基于睾丸PRDM9、转录组和蛋白质组分析的牦牛杂交雄性不育分子机制的研究

The objective of the present study is to explore the mechanism for hybrid male sterility of animals. Yak and its sterile male F1 with cattle (cattle-yak) is used as a natural animal model. We hypothesize that there exist abnormal meiosis and expression of meiosis-related genes in cattle-yak. Techniques of synaptonemal complex spreading, immunofluorescence, transcriptomics, proteomics, epigenetics, biochemistry and molecular biology are employed to compare characteristics of chromosome synapsis and recombination, expressions of corresponding genes and proteins, and epigenetic modification of histone in testes of yak and cattle-yak. The newly discovered hybrid sterility gene Prdm9 which controls recombination hotspots will also be studied, in order to elucidate its possible roles in male sterility of cattle-yak. This project will be carried out at levels of cells, genes and proteins, aiming at providing scientific evidences for elucidating the mechanism of male sterility of cattle-yak. The results will be of significance in the understanding of molecular mechanism of hybrid male sterility and reproduction isolation, expression regulation of tissue-specific genes, mechanisms for species evolution and gene recombination, as well as the utilization of yak hybrid.

本项目的目的是探索动物杂交雄性不育的分子机制。实验以牦牛及其与普通牛的远缘杂交雄性不育后代，即犏牛为天然模型，以睾丸组织减数分裂异常及相关基因表达异常为假设和研究切入点，通过联会复合体铺展、免疫荧光、转录组学、蛋白质组学、表观遗传学及生化与分子生物学的相关技术，系统比较牦牛和犏牛睾丸组织的染色体联会、重组特征及相关基因和蛋白质表达、组蛋白表观遗传学修饰等差异。同时，项目对哺乳动物中新近发现的控制重组热点的杂交不育基因Prdm9进行系统的分析，探索其在犏牛雄性不育中可能发挥的作用。项目从细胞、基因和蛋白水平上进行系统和深入的研究，以期为阐明犏牛雄性不育的分子机制提供全面的科学证据。研究结果对认识杂交雄性不育和生殖隔离的分子机制、组织特异基因表达的调控、物种进化和基因重组机制具有重要理论意义，同时对牦牛的杂交利用具有潜在的应用价值。

课题以四川麦洼牦牛及其杂交后代（犏牛）为动物模型，以杂交不育基因Prdm9为研究切入点，完成了设计的全部内容，取得的主要成果包括：（1）采用3´-RACE等基因克隆技术，首次获得了牦牛和黄牛Prdm9基因完整的cDNA序列，发现该基因包含5个连续的C2H2型锌指，每个锌指为21个氨基酸，不同锌指之间以及牦牛与普通牛之间均存在一些氨基酸差异。值得注意的是，牦牛与普通牛在整个锌指域有6个差异氨基酸，其中5个都在锌指中的重要正向选择位点处。课题从DNA水平上扩增Prdm9基因的锌指结构，初步结果显示，牦牛和黄牛之间扩增片段存在大小差异,显示出基因结构的不同。定量PCR分析显示犏牛睾丸组织中Prdm9相对表达量显著低于牦牛。总之，牦牛与普通牛Prdm9基因序列和结构、睾丸组织中mRNA水平的差异等，可能与犏牛雄性不育直接相关。（2）构建了Prdm9保守区部分片段的原核表达载体，获得了约54 kD的融合蛋白，经纯化后免疫家兔，获得了抗体。用Western blot比较牦牛和犏牛睾丸组织Prdm9蛋白的水平，结果未见显著差异。（3）犏牛睾丸组蛋白H3K4 三甲基化水平显著高于牦牛（P<0.05），这与Prdm9 mRNA水平的变化不一致，原因尚不清楚。（4）组织学研究表明，犏牛大多数曲精小管仅见支持细胞和少量精原细胞，但无精母细胞；有些曲精小管中包含粗线期停滞的精母细胞。牦牛附睾中有精子，而犏牛中没有。细胞凋亡分析表明，犏牛睾丸中精原细胞/精母细胞细胞凋亡显著高于牦牛。我们推测这可能是精子发生障碍导致的。（5）采用双向电泳-质谱技术，比较了牦牛、犏牛睾丸差异表达的蛋白质，在检测到的19种差异表达蛋白中，有13种在犏牛睾丸组织中表达下调。结果提示，犏牛雄性不育涉及多种蛋白质的异常表达。

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