動物細胞内シグナル伝達におけるカルシウム応答性アダプタータンパク質の機能解析

钙反应接头蛋白在动物细胞内信号转导中的功能分析

基本信息

批准号：
14J09452
负责人：
京卓志
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J09452/
关键词：
タンパク質間相互作用カルシウム結合タンパク質小胞輸送

项目摘要

申請書にって、カルシウム結合タンパク質ALG-2とTFGの相互作用が初期分泌経路において果たす役割を検討した。昨年度までに、ALG-2の過剰発現によってTFGのERES局在が顕著になる結果が得られており、その効果とERストレス及びTFG発現量との関連を調べた。まず、ALG-2の過剰発現によって、ERストレスが惹起されるかを調べるために、ALG-2を過剰発現させた細胞のERストレスマーカーの発現量を調べた。ALG-2の過剰発現によってERストレスマーカーの発現が増加しなかったことから、ALG-2の過剰発現とERストレスとの関連は見出されなかった。次に、ALG-2過剰発現細胞におけるTFGの発現量をウエスタンブロッィングで調べた。しかし、ALG-2を過剰発現した細胞と過剰発現していない細胞間で、TFGの量の差はみられなかった。以上の結果から、TFGの局在に対するALG-2過剰発現の効果は、ERストレス及び、TFGの発現量の変化とは独立していることが考えられた。続いて、TFGのさらなる機能解明に向けて、TFGの新規相互作用タンパク質の探索を行った。その結果、TFGの新規相互作用タンパク質候補としてTRAF3を同定した。GFP-TFGとHA-TRAF3を共発現させたHEK293細胞から溶解液を調製し、抗GFP抗体による免疫沈降を行った結果、HA-TRAF3が共沈降した。このことから、TRAF3はTFGと相互作用することが確認された。さらに、免疫染色を行った結果、ゴルジ体様の局在パターンである核の周囲において、GFP-TFGの蛍光シグナルとHA-TRAF3の免疫染色シグナルが部分的に一致した。以上の結果から、初期分泌経路においてTFGとTRAF3の相互作用が何らかの役割を果たす可能性が示唆された。

在本应用中，我们研究了钙结合蛋白ALG-2和TFG之间的相互作用在早期分泌途径中的作用。直到去年，我们得到了ALG-2的过表达使TFG显着定位于ERES的结果，并研究了这种效应与ER应激和TFG表达水平之间的关系。首先，为了检查 ALG-2 的过度表达是否会诱导 ER 应激，我们检查了过度表达 ALG-2 的细胞中 ER 应激标记物的表达水平。由于 ALG-2 过表达不会增加 ER 应激标记物的表达，因此未发现 ALG-2 过表达与 ER 应激之间存在关联。接下来，通过Western印迹检查ALG-2过表达细胞中TFG的表达水平。然而，在过表达 ALG-2 的细胞和不过表达 ALG-2 的细胞之间没有观察到 TFG 量的差异。从以上结果可以认为，ALG-2过表达对TFG定位的影响与ER应激和TFG表达水平的变化无关。接下来，为了进一步阐明TFG的功能，我们寻找新的TFG相互作用蛋白。因此，我们将 TRAF3 确定为 TFG 的候选新型相互作用蛋白。从共表达GFP-TFG和HA-TRAF3的HEK293细胞制备裂解物，并使用抗GFP抗体进行免疫沉淀，结果，HA-TRAF3被共沉淀。这证实了TRAF3与TFG相互作用。此外，免疫染色的结果是，GFP-TFG的荧光信号和HA-TRAF3的免疫染色信号在细胞核周围部分匹配，这是一种类似高尔基体的定位模式。这些结果表明TFG和TRAF3之间的相互作用可能在早期分泌途径中发挥一定作用。