持続的な培地回収システムを用いた高機能エクソソームの探索と薬物送達への応用

使用连续培养基回收系统寻找高功能外泌体及其在药物递送中的应用

• 批准号: 22K19384
• 负责人: 小出 裕之
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: University of Shizuoka
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19384/
• 关键词: エクソソーム; ナノ粒子; 取り込み; 薬物送達; mRNA; 脂質二重膜小胞

本研究ではエクソソームを分泌する親細胞として、発光酵素（N-luciferase (N-luc)）が遺伝子導入されたヒト前立腺がん（PC-3）細胞株を用いた。PC-3細胞を播種してから48時間連続培養後に回収した培地（コントロール）、培地循環装置を用いて細胞播種から2日間連続で回収した培地を精製し、エクソソームを得た。回収したエクソソームについて、動的光散乱法により粒子径を測定した。その結果、両システムにより精製したエクソソームの粒子径は300 nm以下であり、粒子径に差は見られなかった。ウェスタンブロット法によりエクソソームのマーカータンパク質であるCD63の発現を検討した結果、コントロールだけでなく、新システムにより回収したエクソソームにおいてもCD63タンパク質の発現が確認された。これらの結果より、回収した粒子がエクソソームであることが示唆された。また、回収したエクソソームのN-luc由来の発光量をレポーターアッセイにより測定した。その結果、発光量とCD63の発現量に相関があり、エクソソームがN-lucにより発光標識できていることが確認された。次に、エクソソームの細胞内への取り込み実験のために親細胞播種時の細胞数、受容細胞の播種数、エクソソームの添加量、受容細胞の種類を検討した。そして、決定した条件を元に両エクソソームをPC-3細胞へ添加し、その24時間後に細胞の発光強度を測定することで取り込み率を算出した。その結果、通常培養により回収したエクソソームと比較して、Day1、Day2いずれも細胞内への取り込み率が有意に増加していた。以上より、細胞培養中にエクソソームを持続的に回収することで、これまでとは異なる性質のエクソソームが回収可能であることが示唆された。

在这项研究中，人类前列腺癌（PC-3）细胞系被用作分泌外泌体的母细胞。 PC-3细胞接种后，培养基恢复了48小时，并使用培养基循环装置纯化细胞播种后连续两天恢复培养基，并从细胞播种中连续两天回收培养基以获得外泌体。通过动态光散射测量收集的外泌体的粒径。结果，使用两个系统纯化的外泌体的粒径为300 nm或更少，并且在粒径中未观察到差异。由于检查了CD63的表达，外泌体标记蛋白通过蛋白质印迹的表达不仅在对照组中，而且在新系统回收的外泌体中得到了证实。这些结果表明恢复的颗粒是外泌体。此外，通过记者测定法测量了从收集的外泌体N-Luc发出的光量。结果，发光量与CD63表达的量之间存在相关性，并且可以证实，外泌体用N-Luc标记为发光。接下来，为了实验外泌体进入细胞的实验，母细胞播种时的细胞数量，受体细胞的数量，播种的量，添加了外泌体的量以及受体细胞的类型。根据确定的条件，将两个外泌体添加到PC-3细胞中，并在24小时后测量细胞的发光强度以计算摄取速率。结果，与正常培养物回收的外泌体相比，第1天和第2天的细胞内摄取率显着增加。从以上，已经提出，在细胞培养过程中，外泌体的连续恢复可以导致与以前不同性质的外泌体的恢复。

项目成果

凍結融解による簡便なタンパク質内封リポソームの調製とタンパク質の細胞内送達への応用

冻融法简单制备包封蛋白质的脂质体及其在细胞内递送蛋白质中的应用

• 发表时间: 2022
• 作者: 平田真也;小出裕之;落合広樹;鈴木ひかる;出羽毅久;奥 直人;浅井知浩
• 通讯作者: 浅井知浩

Increasing the siRNA knockdown efficiency of lipid nanoparticles by morphological transformation with the use of dihydrosphingomyelin as a helper lipid

使用二氢鞘磷脂作为辅助脂质通过形态转化提高脂质纳米颗粒的 siRNA 敲除效率

• DOI: 10.1039/d3bm00068k
• 发表时间: 2023
• 期刊: Biomaterials Science
• 影响因子: 6.6
• 作者: Hashimoto Masahiro;Yonezawa Sei;Furan Song;Nitta Chiori;Maeda Noriyuki;Tomita Koji;Yokouchi Ayano;Koide Hiroyuki;Asai Tomohiro
• 通讯作者: Asai Tomohiro

脂凍結融解技術を駆使した核酸・タンパク質送達方法の開発

利用脂肪冻融技术开发核酸/蛋白质递送方法

• 发表时间: 2022
• 作者: 小出 裕之;米澤 正;出羽 毅久;奥 直人;浅井 知浩
• 通讯作者: 浅井 知浩

消化管で標的分子を吸着する機能性ナノ粒子開発

开发吸附胃肠道目标分子的功能性纳米颗粒

• 发表时间: 2022
• 作者: Hirofumi Tomikawa;Yo Nagano;Kaneto Tsunemitsu;Mitsuhiro Terakawa;小出裕之
• 通讯作者: 小出裕之

経口投与されたポリマーナノ粒子の体内動態に影響を与える因子の模索

探索影响口服聚合物纳米颗粒药代动力学的因素

• 发表时间: 2022
• 作者: 安野 豪;小出裕之;米澤 正;浅井知浩
• 通讯作者: 浅井知浩