植物病原糸状菌に対する「RNA農薬」の技術的基盤の構築

植物病原真菌“RNA农药”技术基地建立

• 批准号: 22K19181
• 负责人: 中屋敷 均
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Kobe University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19181/
• 关键词: いもち病菌; RNA; RNAi; マイコウイルス; 生物防除

本年度は、本実験計画にある「RNA農薬」の実現に必須であるマイコウイルスのクローニングおよびin vitro転写系の構築を行った。RNA農薬の土台となる因子の候補は、これまでにRNAのみで感染が起こると報告されているDiaporthe ambigua RNA virus1（DaRV1）と類縁のPyricularia oryzae umbra-like virus 1（PoUV1）と命名したウイルスである。PoUV1の5'RACEおよび3'RACEを行い末端配列を決定した後に全長cDNAをクローニングした。またこのcDNAにPCRを用いてT3およびT7プロモーター配列を付加してin vitroで二本鎖のウイルスRNAを合成できることを確認した。現在、このdsRNAをリポソーム、PEG等を用いて、菌糸や胞子に導入することを試みている。また、より簡易な方法としてPoOLV1のサテライトRNAを用いた「RNA農薬」の開発も試みており、二種のサテライトRNA（ARNA１およびARNA3）の全長cDNAのクローニングを試みている。ARNA1については、クローニングが済んでおり、PoUV1と同様にT7やT3プロモーターを付加してRNAの合成に成功した。ARNA3は過去にRNA-seqからインシリコで構築した配列に間違いがあることが判明し、現在これを再構築してクローニングを試みている。ARNA1に関しては配列内にモデル遺伝子であるGFPなどを組込み、実際に遺伝子サイレンシングを誘導できるか、そのためのコンストラクトを現在作成しているところである。

今年，我们克隆了菌病毒，这对于实现该实验计划中列出的“ RNA农药”以及构建体外转录系统至关重要。候选RNA农药的候选者是一种称为Pyricularia oryzae umbra样病毒1（POUV1）的病毒，这是一种相关的日志脉络膜RNA病毒1（DARV1），以前据报道会引起只有RNA的感染。在5'5'时，将全长cDNA克隆，并执行POUV1的3'race以确定末端序列。此外，可以通过使用PCR将T3和T7启动子序列在该cDNA中添加T3和T7启动子序列，从而在体外合成双链病毒RNA。目前，我们正在尝试使用脂质体，钉子等将此dsRNA引入菌丝和孢子。此外，作为一种更简单的方法，我们还尝试使用Poolv1卫星RNA来开发“ RNA农药”，并试图克隆两种类型的卫星RNAS RNAS RNAS RNAS RNAS（ARNA1和ARNA1和ARNA3）的完整长度CDNA。 ARNA1已被克隆，并且像POUV1一样，通过添加T7和T3启动子成功合成了RNA。已经发现，ARNA3过去在RNA-Seq中构建的硅构建的序列中有一个错误，目前正在尝试重建并克隆它。关于ARNA1，我们目前正在为模型基因GFP等是否可以纳入序列中，以实际诱导基因沉默。