Elucidation of high gravity-sensing mechanisms in cells and its application to control cellular phenotype and differentiation

阐明细胞中的高重力感应机制及其在控制细胞表型和分化中的应用

基本信息

批准号：
22K19898
负责人：
坂元尚哉
金额：
$ 3.99万
依托单位：
Tokyo Metropolitan University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度はまず二次元平面基質に培養した細胞への高重力負荷を行った．カバーガラス上に培養した平滑筋細胞に対してプレート遠心分離機を用い，通常培養状態での重力方向である細胞下向きに1000gの高重力を１０分間にわたって負荷した．その後，細胞骨格であるアクチンフィラメントおよび微小管，また細胞核を蛍光染色により可視化し，それぞれ顕微鏡観察を行った．その結果，通常重力環境（１g）で培養した細胞と比較し，細胞骨格構造および細胞核形状ともに高重力負荷の顕著な影響は認められなかった．このことから，細胞鉛直下方向への高重力負荷は細胞構造に変化を与えないことが示唆された．さらに，細胞の側方向からの重力負荷も試みた．遠沈管内にシリコーンゴム製の台座を設置し，カバーガラスを立てた状態で遠心分離を行った．その結果，台座およびカバーガラスともに高重力の影響と考えられる破損が生じ，細胞観察まで至らなかった．また，高重力環境による細胞形質変化の評価に用いるPCR法の確立を行った．特に，コラーゲンゲル基質中に包埋した平滑筋細胞からのRNA抽出方法に関して，サンプル保存および破砕方法，使用する溶媒，またスピンカラムの組み合わせを検討した．抽出の際にRNAが破壊されるケースも存在したものの，結果的に安定的なRNA抽出方法を確立することができた．その後，平滑筋細胞の表現型制御培養液を用いて，遠心圧縮したコラーゲンゲル中の平滑筋細胞を合成型から収縮型に誘導した後，RNAを抽出した．PCR法により収縮型平滑筋細胞マーカーである平滑筋ミオシン重鎖や平滑筋αアクチンの発現量増加を確認できた．

今年，我们首先将高重力载荷应用于在二维平面底物上培养的细胞。在盖玻片上培养的平滑肌细胞用于在10分钟内沿细胞的向下方向施加一个板离心，这是正常培养状态下的重力方向。之后，通过荧光染色可观察到细胞骨架肌动蛋白，微管和细胞核，并进行了微观观察。结果，与在正常重力环境中培养的细胞相比，在细胞骨架结构和细胞核的形状中均未观察到高重力负荷的显着影响。这表明，在细胞的垂直向下方向上的高重力载荷不会改变细胞结构。此外，我们还试图从细胞的侧面携带重力。放置一个硅胶橡胶底座，在离心管内部放置，盖玻璃用盖玻璃升起。结果，基座和盖玻璃都被损坏，这被认为是高重力的影响，并且未观察到细胞。此外，还建立了一种PCR方法，用于评估由于高重力环境而引起的细胞性状变化。特别是，我们研究了从嵌入胶原蛋白凝胶底物中的平滑肌细胞中提取RNA的方法，以及样品存储和破坏，所使用的溶剂和自旋柱的组合。尽管在提取过程中有RNA被破坏的情况，但仍建立了一种稳定的提取RNA的方法。之后，使用平滑肌细胞的表型对照介质从合成至收缩形式诱导离心压缩胶原蛋白凝胶中的平滑肌细胞，然后提取RNA。 PCR证实，观察到平滑肌肌球蛋白重链和平滑肌α肌动蛋白的表达水平增加，它们是收缩的平滑肌细胞标记物。