Elucidation of high gravity-sensing mechanisms in cells and its application to control cellular phenotype and differentiation
阐明细胞中的高重力感应机制及其在控制细胞表型和分化中的应用
基本信息
- 批准号:22K19898
- 负责人:
- 金额:$ 3.99万
- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
- 财政年份:2022
- 资助国家:日本
- 起止时间:2022-06-30 至 2024-03-31
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
今年度はまず二次元平面基質に培養した細胞への高重力負荷を行った.カバーガラス上に培養した平滑筋細胞に対してプレート遠心分離機を用い,通常培養状態での重力方向である細胞下向きに1000gの高重力を10分間にわたって負荷した.その後,細胞骨格であるアクチンフィラメントおよび微小管,また細胞核を蛍光染色により可視化し,それぞれ顕微鏡観察を行った.その結果,通常重力環境(1g)で培養した細胞と比較し,細胞骨格構造および細胞核形状ともに高重力負荷の顕著な影響は認められなかった.このことから,細胞鉛直下方向への高重力負荷は細胞構造に変化を与えないことが示唆された.さらに,細胞の側方向からの重力負荷も試みた.遠沈管内にシリコーンゴム製の台座を設置し,カバーガラスを立てた状態で遠心分離を行った.その結果,台座およびカバーガラスともに高重力の影響と考えられる破損が生じ,細胞観察まで至らなかった.また,高重力環境による細胞形質変化の評価に用いるPCR法の確立を行った.特に,コラーゲンゲル基質中に包埋した平滑筋細胞からのRNA抽出方法に関して,サンプル保存および破砕方法,使用する溶媒,またスピンカラムの組み合わせを検討した.抽出の際にRNAが破壊されるケースも存在したものの,結果的に安定的なRNA抽出方法を確立することができた.その後,平滑筋細胞の表現型制御培養液を用いて,遠心圧縮したコラーゲンゲル中の平滑筋細胞を合成型から収縮型に誘導した後,RNAを抽出した.PCR法により収縮型平滑筋細胞マーカーである平滑筋ミオシン重鎖や平滑筋αアクチンの発現量増加を確認できた.
今年,我们首先对二维平面基质上培养的细胞施加高重力负载。使用平板离心机,将在盖玻片上培养的平滑肌细胞沿细胞向下的方向(这是正常培养条件下的重力方向)承受1000g的高重力10分钟。然后,使用荧光染色对细胞骨架、肌动蛋白丝和微管以及细胞核进行可视化,并使用显微镜观察每一个。结果,与在正常重力环境(1g)中培养的细胞相比,没有观察到高重力负载对细胞骨架结构或细胞核形状的显着影响。这表明细胞垂直方向的高重力载荷不会改变细胞结构。此外,我们还尝试从电池侧面施加重力载荷。将硅橡胶基座置于离心管内,并在盖玻片直立的情况下进行离心。结果,基座和盖玻片都被损坏,可能是由于高重力的影响,并且无法观察到细胞。我们还建立了一种 PCR 方法来评估高重力环境引起的细胞性状变化。特别是,关于从嵌入胶原凝胶基质的平滑肌细胞中提取 RNA 的方法,我们研究了样品保存和破碎方法、所用溶剂和旋转柱组合。虽然在提取过程中存在RNA被破坏的情况,但我们能够建立稳定的RNA提取方法。然后,使用平滑肌细胞表型对照培养基将离心压缩的胶原凝胶中的平滑肌细胞从合成型诱导至收缩型,并提取RNA。通过 PCR,我们证实平滑肌肌球蛋白重链和平滑肌 α-肌动蛋白(收缩性平滑肌细胞的标记)的表达水平增加。
项目成果
期刊论文数量(0)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Phenotypic States of Smooth Muscle Cells in a Coculture Model under Higher Wall Shear Stress Condition
高壁剪切应力条件下共培养模型中平滑肌细胞的表型状态
- DOI:
- 发表时间:2022
- 期刊:
- 影响因子:0
- 作者:Sawasaki K;Nakamura M;Kimura N;Kawahito K;Fujie H;Sakamoto N
- 通讯作者:Sakamoto N
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