空間的トランスオミクス解析による異所性骨化過程の解析と疾患応用

空间跨组学分析异位骨化过程及疾病应用

• 批准号: 22K19600
• 负责人: 金 永輝
• 金额: $ 4.08万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-06-30 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19600/
• 关键词: 異所性骨化; 空間的遺伝子発現解析; イメージング質量分析; 進行性骨化性線維異形成症; エネルギー代謝; 空間的トランスオミックス解析

異所性骨化（HO）とは、生理的には骨が形成されない軟部組織内に骨が形成される現象である。外傷により局所的に形成する異所性骨化とは異なり、遺伝性疾患である進行性骨化性線維異形成症（FOP）はACVR1遺伝子変異（FOP-ACVR1）により、全身の線維性組織が進行性に骨化する疾患である。我々はFOP患者から樹立したiPS細胞を用いて、体外における実験系を確立し、HO誘発因子としてActivin Aの同定や治療のターゲットとしてmTORC1の阻害剤であるRapamycinを同定した。さらに、mTORC1の下流を解析する中、エネルギー代謝のリプログラミングが重要な役割を果たす知見を見出した。HO初期に浸潤する炎症性細胞、特にマクロファージも重要な役割を担うことが報告された。本課題の目的は、薬剤誘導型FOP-ACVR1トランスジェニックマウスを用いて、空間的技術を駆使し、HO形成に寄与する起源細胞とマクロファージのエネルギー代謝のダイナミックや相互作用を解明することである。令和４年度は、空間的遺伝子発現解析（Visium）のプロトコールを確立した。具体的には、HE染色により凍結切片とFFPE切片を比較し、マウス骨格筋の分解能が高い画像を得るために、FFPE切片を採用した。また、接着テストとNGSライブラリ作製などの条件検討を行い、適切なプロトコールを確立した。また、エネルギー代謝状態を可視化するために、イメージング質量分析（IMS）を行った。得られたデータを元に、次元削減法（UMAP）の解析により、HO領域と正常領域の異なるパターンを可視化することができた。更に、遺伝子発現を単一細胞レベルで解析するために、マウスの骨格筋から単核細胞の単離からNGSライブラリ作製までのプロトコールを検討し、シングルセルRNAシーケンシングを行った。その結果を解析中である。

异位骨化（HO）是在骨骼在生理上形成的软组织中形成骨骼的现象。与异位骨化不同，该骨化是由创伤局部形成的，遗传疾病的进行性骨化性纤维肿瘤（FOP）是一种疾病，是一种疾病，其中纤维组织在整个体内逐渐被ACVR1基因突变逐渐渗透（FOP-ACVR1）。使用由FOP患者建立的IPS细胞，我们在体外建立了一个实验系统，将激活素A鉴定为HO诱导蛋白A诱导蛋白，而Rapamycin（MTORC1的抑制剂）是治疗靶标。此外，我们发现重编程能量代谢在分析下游MTORC1中起重要作用。据报道，在HO早期浸润的炎症细胞，尤其是巨噬细胞也起着重要作用。该主题的目的是使用药物诱导的FOP-ACVR1转基因小鼠来阐明原点细胞和巨噬细胞之间能量代谢的动力学和相互作用，这些动力和相互作用通过使用空间技术有助于HO形成。在2022年，建立了用于空间基因表达分析（visium）的方案。具体而言，使用FFPE切片来比较染色的冷冻切片和FFPE切片，并获得具有小鼠骨骼肌肌肉的图像。此外，还检查了诸如粘附测试和NGS库制备之类的条件，并建立了适当的方案。还进行了成像质谱（IMS）以可视化能量代谢状态。基于获得的数据，可以通过降低维度分析（UMAP）来可视化HO和正常区域的不同模式。此外，为了分析单细胞水平的基因表达，研究了一种从小鼠骨骼肌分离到NGS文库制备的单核细胞的方案，并进行了单细胞RNA测序。结果目前正在分析。