エピゲノム破綻から見るゲノム安定型胃癌の発癌機構と腫瘍内不均一性獲得原理の解明

从表观基因组破坏角度阐明基因组稳定胃癌的癌变机制及瘤内异质性的获取原理

• 批准号: 22KJ2474
• 负责人: 井野 雄貴
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2474/
• 关键词: 腫瘍内不均一性; エピジェネティクス; DNAメチル化

令和４年度は、悪性腫瘍エピゲノムの空間情報を取得するために、FFPE（ホルマリン固定パラフィン包埋）アーカイブ由来のDNAからメチローム情報を取得するための手法の開発に取り組んだ。DNAメチル化を解析するための手法として全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（WGBS）がある。バイサルファイト処理されたDNA（BS-DNA）のサイズ分布は500塩基長から数千塩基長であるが、現行のWGBSライブラリのリード長は数百塩基長にとどまっている。そのため、同一染色体上で連鎖しているメチル化パターンの決定や、インプリント遺伝子のアレル識別が困難であり、現行法よりもリード長が長いWGBSライブラリ作製法が待たれている。また、本研究は腫瘍特定領域のゲノム情報・エピゲノム情報の取得を前提としているため、微小量のサンプルを増幅可能なライブラリとする必要がある。以上を踏まえると、BS-DNAの全長の相補鎖の両端にシーケンスアダプターを結合する新しい戦略が必要となる。まず、FFPEを由来としないBS-DNAについて、その全長を合成することができるDNAポリメラーゼを探索した。そのために、BS-DNAの3′末端に既知配列のアダプターを連結し、その相補鎖をプライマーとして利用するアッセイ系を用意した。その系でDNAポリメラーゼの合成能を評価すると、損傷乗り越え型DNAポリメラーゼIVのホモログが他のDNAポリメラーゼよりも伸長効率が高いことがわかった。また、鋳型鎖と新生鎖を別々の蛍光で標識し、新生鎖のサイズ分布が鋳型BS-DNAと同様であることを確認した。次に、伸長後の二本鎖DNAの伸長末端にアダプターを結合させ、新生鎖の両端にアダプターを結合させることを試みた。そのようにして作成されたライブラリをPCR反応にかけてサイズ分布を確認すると、500塩基長の増幅されたライブラリを確認することができた。

2020财年，我们致力于开发一种从FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）档案中提取的DNA中获取甲基化组信息的方法，以获得恶性肿瘤表观基因组的空间信息。全基因组亚硫酸氢盐测序 (WGBS) 是一种分析 DNA 甲基化的方法。亚硫酸氢盐处理的 DNA (BS-DNA) 的大小分布范围为 500 个碱基到数千个碱基，但当前 WGBS 文库的读长仅为几百个碱基。因此，很难确定同一染色体上连锁的甲基化模式并鉴定印记基因的等位基因，因此需要比现有方法具有更长读长的WGBS文库生产方法。此外，由于这项研究是基于特定肿瘤区域的基因组和表观基因组信息的获取，因此有必要创建一个可以扩增少量样本的文库。鉴于上述情况，需要一种新的策略将序列适配器连接到 BS-DNA 全长互补链的两端。首先，我们寻找一种可以合成并非源自 FFPE 的全长 BS-DNA 的 DNA 聚合酶。为此，我们准备了一个检测系统，其中将具有已知序列的接头连接到BS-DNA的3'端，并使用其互补链作为引物。当在该系统中评估DNA聚合酶的合成能力时，发现超越损伤的DNA聚合酶IV的同源物比其他DNA聚合酶具有更高的延伸效率。另外，用单独的荧光标记模板链和新生链，并证实新生链的大小分布与模板BS-DNA的大小分布相似。接下来，他们尝试将接头连接到伸长的双链 DNA 的延伸端，并将接头连接到新生链的两端。当由此创建的文库进行PCR反应并检查大小分布时，确认了长度为500个碱基的扩增文库。

项目成果

ナノポアシーケンサーによる全ゲノムバイサルファイトシークエンシング

使用纳米孔测序仪进行全基因组亚硫酸氢盐测序

• 发表时间: 2022
• 作者: 小畑 智暉;宋 普錫;祢冝 淳太郎;小畑 智暉 髙橋 宏和 中園 幹生 射場 厚 袮冝 淳太郎;井野 雄貴 三浦史仁 伊藤隆司
• 通讯作者: 井野 雄貴 三浦史仁 伊藤隆司