エピゲノム破綻から見るゲノム安定型胃癌の発癌機構と腫瘍内不均一性獲得原理の解明

从表观基因组破坏角度阐明基因组稳定胃癌的癌变机制及瘤内异质性的获取原理

• 批准号: 22KJ2474
• 负责人: 井野 雄貴
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ2474/
• 关键词: 腫瘍内不均一性; エピジェネティクス; DNAメチル化

令和４年度は、悪性腫瘍エピゲノムの空間情報を取得するために、FFPE（ホルマリン固定パラフィン包埋）アーカイブ由来のDNAからメチローム情報を取得するための手法の開発に取り組んだ。DNAメチル化を解析するための手法として全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（WGBS）がある。バイサルファイト処理されたDNA（BS-DNA）のサイズ分布は500塩基長から数千塩基長であるが、現行のWGBSライブラリのリード長は数百塩基長にとどまっている。そのため、同一染色体上で連鎖しているメチル化パターンの決定や、インプリント遺伝子のアレル識別が困難であり、現行法よりもリード長が長いWGBSライブラリ作製法が待たれている。また、本研究は腫瘍特定領域のゲノム情報・エピゲノム情報の取得を前提としているため、微小量のサンプルを増幅可能なライブラリとする必要がある。以上を踏まえると、BS-DNAの全長の相補鎖の両端にシーケンスアダプターを結合する新しい戦略が必要となる。まず、FFPEを由来としないBS-DNAについて、その全長を合成することができるDNAポリメラーゼを探索した。そのために、BS-DNAの3′末端に既知配列のアダプターを連結し、その相補鎖をプライマーとして利用するアッセイ系を用意した。その系でDNAポリメラーゼの合成能を評価すると、損傷乗り越え型DNAポリメラーゼIVのホモログが他のDNAポリメラーゼよりも伸長効率が高いことがわかった。また、鋳型鎖と新生鎖を別々の蛍光で標識し、新生鎖のサイズ分布が鋳型BS-DNAと同様であることを確認した。次に、伸長後の二本鎖DNAの伸長末端にアダプターを結合させ、新生鎖の両端にアダプターを結合させることを試みた。そのようにして作成されたライブラリをPCR反応にかけてサイズ分布を確認すると、500塩基長の増幅されたライブラリを確認することができた。

在2022年，为了获取有关恶性肿瘤表观基因质组的空间信息，我们致力于开发一种从FFPE（福尔马林固定的石蜡装满）档案中从DNA获取甲基信息信息的方法。用于分析DNA甲基化的技术是全基因组Bisulfite测序（WGB）。 Bisulfite处理的DNA（BS-DNA）的尺寸分布为500至数千个基部，而当前的WGBS库的读数仅读取数百个碱基。因此，很难确定在同一染色体上连接的甲基化模式并识别印迹基因的等位基因，并且等待WGBS库生产方法的铅长度比当前方法更长。此外，由于本研究假设对特定肿瘤区域的基因组和表观基因组信息获得，因此必须制作一个可以扩增少量样品的文库。鉴于上述，需要一种新的策略来将序列适配器与BS-DNA的全长互补链的两端结合。首先，我们搜索了可以合成未从FFPE得出的BS-DNA的全长的DNA聚合酶。为此，制定了一个测定系统，其中已知序列的适配器与BS-DNA的3'末端有关，并用作互补链作为底漆。当评估该系统中DNA聚合酶的能力时，发现损伤残留的DNA聚合酶IV的同源物具有比其他DNA聚合酶更高的伸长效率。此外，模板链和新链带有单独的荧光标记，并确认新链的尺寸分布与模板BS-DNA的尺寸分布相同。接下来，在延伸后将适配器连接到双链DNA的延伸端，并将适配器连接到新链的两端。通过进行PCR反应以检查如此创建的库的尺寸分布，我们能够以500个碱基的长度确认放大的库。

项目成果

ナノポアシーケンサーによる全ゲノムバイサルファイトシークエンシング

使用纳米孔测序仪进行全基因组亚硫酸氢盐测序

• 发表时间: 2022
• 作者: 小畑 智暉;宋 普錫;祢冝 淳太郎;小畑 智暉 髙橋 宏和 中園 幹生 射場 厚 袮冝 淳太郎;井野 雄貴 三浦史仁 伊藤隆司
• 通讯作者: 井野 雄貴 三浦史仁 伊藤隆司