移動性分子による経世代的エピジェネティック伝達の制御機構の解明

阐明移动分子跨代表观遗传传递的控制机制

• 批准号: 22KJ3075
• 负责人: 筒井 大貴
• 金额: $ 3.08万
• 依托单位: Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2023
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2023-03-08 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ3075/
• 关键词: DNAメチル化; シロイヌナズナ; 環境応答; ストレス; エピジェネティクス

本研究は、シロイヌナズナへのストレス処理によって誘導されて世代を越えて伝わるエピジェネティックな修飾の確立過程を時系列で捉えることを目的としている。そのためには、少数の細胞もしくは核から、全ゲノム規模のDNAメチル化解析を行う必要がある。しかし、RNAと違ってDNAは１細胞あたりの量が非常に少なく、これまでは技術的に困難であった。本年度は、シロイヌナズナ卵細胞をモデルケースとして、少数細胞からのDNAメチル化解析技術の改良と、卵細胞におけるDNAメチル化プロファイルの詳細な解析を行った。研究代表者は、これまでもバイサルファイト法を用いて卵細胞の全ゲノムメチル化解析を実施していたが、得られたリードのマップ率やゲノムに対するカバー率は低く、改良が必要であった。そこで、本年度は、近年開発された酵素変換法による全ゲノムメチル化解析を試みた。酵素変換法は、TET2およびAPOBECと呼ばれる２つの酵素を使い、非メチル化シトシンをウラシルに変換することでシトシンにおけるメチル化の有無を判定する方法である。バイサルファイト法に比べて穏やかな条件で反応を行うことができるので、DNAの分解が少ないとされている。その結果、バイサルファイト法に比べて高いマップ率が得られ、シーケンスデータあたりのゲノムカバー率も高かった。また、卵細胞で発現しているメチル基転移酵素の変異体からも卵細胞を回収し、シーケンスを実施した。

本研究的目的是了解拟南芥胁迫处理诱导建立表观遗传修饰并代代相传的时间过程。为了实现这一目标，有必要对少量细胞或细胞核进行全基因组 DNA 甲基化分析。然而，与RNA不同的是，每个细胞的DNA量非常小，迄今为止这在技术上一直很困难。今年，我们以拟南芥卵细胞为模型案例，从少量细胞出发改进了DNA甲基化分析技术，对卵细胞中的DNA甲基化谱进行了详细分析。主要研究者此前曾利用亚硫酸氢盐法对卵细胞进行全基因组甲基化分析，但获得的reads的作图率和基因组覆盖率较低，有待改进。因此，今年，我们尝试使用最近开发的酶促转化方法进行全基因组甲基化分析。酶转化法使用TET2和APOBEC两种酶将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，从而确定胞嘧啶是否存在甲基化。由于该反应可以在比亚硫酸氢盐法更温和的条件下进行，因此据说 DNA 降解较少。结果，与亚硫酸氢盐法相比，获得了更高的作图率，并且每个序列数据的基因组覆盖率也更高。此外，还回收了卵细胞中表达的突变型甲基转移酶的卵细胞并进行了测序。