デアミノノイラミン酸残基特異的な新規シアリダーゼ(KDNase)-酵素の化学構造および立体構造の解析と既知シアリダーゼとの比較

新型脱氨基神经氨酸残基特异性唾液酸酶 (KDNase) - 分析酶的化学和三级结构并与已知唾液酸酶进行比较

基本信息

批准号：
08878090
负责人：
北島健
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

既知のシアリダーゼに抵抗性を示すKDN(デアミノノイラミン酸)残基を特異的に加水分解する酵素(KDNase)は、シアル酸炭素骨格の5位の水酸基とアミノアシル基を厳密に区別する。本研究は、このシアル酸識別機構をKDNaseの触媒反応機構と化学および立体構造的見地から解明することを目的として行い、以下の結果を得た。1.KDNaseSMの速度論的解析:精製酵素を用い、酵素反応の速度論的解析を合成および天然基質、また阻害剤を用いて行うとともに、基質の加水分解反応におけるKDNの立体配置の経時変化をNMRによって分光学的に追跡した。その結果、KDNaseは、炭素骨格の5位の置換基の認識が厳密であるものの、従来のシアリダーゼ触媒と同様の遷移状態を経由する共通の反応機構が存在することが明らかになった。2.Sphingobacterium multivorum由来KDNaseSMの分子クローニングと化学構造解析:精製酵素の部分アミノ酸配列を決定する。このアミノ酸配列から推定される合成オリゴヌクレオチド・プローブをもちいて、酵素をコードするcDNAをスクリーニングし、更にそのcDNAの塩基配列決定を行った。現在、ほぼ全アミノ酸配列の推定が成功したところである。明らかにされたアミノ酸配列の範囲内では、既知のシアリダーゼのアミノ酸配列との相同性はあまり見出されていない。3.KDNaseSMの結晶構造解析を目指した酵素の大量調製:KDNaseは、誘導酵素であり、KDNのαケトシドによって、S.multivorum中に誘導されることが確かめられた。現在、(2)で得られたcDNAから酵素を大腸菌に発現させて、酵素に対する抗体を調製中であり、抗体を用いた1段階精製法を確立を目指しているところである。

一种特异性水解对已知唾液酸酶具有耐药性的kDN（脱氨基甲甲酰氨酸）残基的酶（KDNase），严格区分了位置5的羟基和碳唾液酸甲酸甲酸主链中的氨基酰基基团。进行这项研究的目的是从KDNase的催化反应机理及其化学和构象观点阐明这种唾液酸歧视机制，并获得了以下结果。 1。KDNasesm的动力学分析：使用纯化的酶和使用天然底物和抑制剂对酶反应进行动力学分析，以及底物水解反应中KDN构型的时间过程，在光谱上随后是NMR。结果，已经揭示了KDNase在碳主链的5位处的取代基有严格的识别，但是通过过渡态具有类似于常规的唾液酸酶催化剂的过渡态，具有共同的反应机制。 2。来自多链球菌的KDNasesm的分子克隆和化学结构分析：确定纯化酶的部分氨基酸序列。使用从该氨基酸序列推论的合成寡核苷酸探针，筛选编码该酶的cDNA，并进一步测序cDNA。目前，几乎所有氨基酸序列都已成功估计。在揭示的氨基酸序列中，已经发现已知的唾液酸酶氨基酸序列几乎没有同源性。 3。旨在分析KDNasesm晶体结构的酶的大规模制备：KDNase是一种可诱导的酶，并被KDN的α-酮糖苷在多螺旋体中诱导。当前，该酶在（2）中获得的cDNA中以大肠杆菌表达，以制备酶的抗体，其目的是使用抗体建立一步纯化方法。

项目成果

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