デアミノノイラミン酸残基特異的な新規シアリダーゼ(KDNase)-酵素の化学構造および立体構造の解析と既知シアリダーゼとの比較

新型脱氨基神经氨酸残基特异性唾液酸酶 (KDNase) - 分析酶的化学和三级结构并与已知唾液酸酶进行比较

基本信息

批准号：
08878090
负责人：
北島健
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

既知のシアリダーゼに抵抗性を示すKDN(デアミノノイラミン酸)残基を特異的に加水分解する酵素(KDNase)は、シアル酸炭素骨格の5位の水酸基とアミノアシル基を厳密に区別する。本研究は、このシアル酸識別機構をKDNaseの触媒反応機構と化学および立体構造的見地から解明することを目的として行い、以下の結果を得た。1.KDNaseSMの速度論的解析:精製酵素を用い、酵素反応の速度論的解析を合成および天然基質、また阻害剤を用いて行うとともに、基質の加水分解反応におけるKDNの立体配置の経時変化をNMRによって分光学的に追跡した。その結果、KDNaseは、炭素骨格の5位の置換基の認識が厳密であるものの、従来のシアリダーゼ触媒と同様の遷移状態を経由する共通の反応機構が存在することが明らかになった。2.Sphingobacterium multivorum由来KDNaseSMの分子クローニングと化学構造解析:精製酵素の部分アミノ酸配列を決定する。このアミノ酸配列から推定される合成オリゴヌクレオチド・プローブをもちいて、酵素をコードするcDNAをスクリーニングし、更にそのcDNAの塩基配列決定を行った。現在、ほぼ全アミノ酸配列の推定が成功したところである。明らかにされたアミノ酸配列の範囲内では、既知のシアリダーゼのアミノ酸配列との相同性はあまり見出されていない。3.KDNaseSMの結晶構造解析を目指した酵素の大量調製:KDNaseは、誘導酵素であり、KDNのαケトシドによって、S.multivorum中に誘導されることが確かめられた。現在、(2)で得られたcDNAから酵素を大腸菌に発現させて、酵素に対する抗体を調製中であり、抗体を用いた1段階精製法を確立を目指しているところである。

特异性水解已知对唾液酸酶具有抗性的 KDN（脱氨基神经氨酸）残基的酶（KDNase）严格区分唾液酸碳骨架 5 位的羟基和氨酰基。本研究的目的是从KDNase的催化反应机制以及化学和三维结构的角度阐明这种唾液酸识别机制，并获得以下结果。 1. KDNaseSM 的动力学分析：使用纯化的酶，我们对合成和天然底物以及抑制剂的酶促反应进行了动力学分析，并通过光谱研究了 KDN 构象在底物水解反应过程中随时间的变化。核磁共振。结果表明，尽管 KDNase 严格识别碳骨架 5 位的取代基，但存在一个共同的反应机制，涉及与传统唾液酸酶催化剂类似的过渡态。 2.多食鞘氨醇杆菌KDNaseSM的分子克隆和化学结构分析：确定纯化酶的部分氨基酸序列。使用由该氨基酸序列推导的合成寡核苷酸探针，筛选编码该酶的cDNA，并确定该cDNA的碱基序列。目前，我们已经成功推导了几乎完整的氨基酸序列。在所揭示的氨基酸序列范围内，未发现与已知唾液酸酶的氨基酸序列有太多同源性。 3.用于KDNaseSM晶体结构分析的酶的大规模制备：KDNase是一种诱导酶，并且已证实它在S. multivorum中被KDN的α-酮苷诱导。目前，我们正在利用(2)中获得的cDNA在大肠杆菌中表达该酶并制备针对该酶的抗体，并旨在建立一种使用抗体的一步纯化方法。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

数据更新时间：{{ journalArticles.updateTime }}

DOI：
{{ item.doi }}
发表时间：
{{ item.publish_year }}
期刊：
{{ item.journal_name }}
影响因子：
{{ item.factor }}
作者：
{{ item.authors }}
通讯作者：
{{ item.author }}

数据更新时间：{{ journalArticles.updateTime }}

作者：
{{ item.author }}

数据更新时间：{{ monograph.updateTime }}

作者：
{{ item.author }}

数据更新时间：{{ sciAawards.updateTime }}

作者：
{{ item.author }}

数据更新时间：{{ conferencePapers.updateTime }}

作者：
{{ item.author }}

数据更新时间：{{ patent.updateTime }}

北島健其他文献

Crystal structure of the galectin-9 N-terminal carbohydrate recognition domain from MUS musculus reveals basic mechanism of carbohydrate recognition.

MUS musculus 半乳糖凝集素 9 N 末端碳水化合物识别结构域的晶体结构揭示了碳水化合物识别的基本机制。

DOI：
发表时间：
2006
期刊：
J. Biol. Chem. 281
影响因子：
0
作者：
佐藤ちひろ;北島健;佐藤ちひろ;Helle F.Jorgensen;Toru Sato;Yu-ichi Fujimura;遠藤充浩;Kyo-ichi Isono;Kyo-ichi Isono;L.-H.Lu et al.;N.Miyanishi et al.;M.Nagae et al.
通讯作者：
M.Nagae et al.

A newly identified zona pellucida glycoprotein ・・・

一种新发现的透明带糖蛋白...

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
Biochem.J. 383
影响因子：
0
作者：
佐藤ちひろ;北島健;佐藤ちひろ;C.Sato;S.Miyata et al.;S.Asahina et al.;A.Fujita et al.;E.Y.Nikonova et al.;T.Nishikawa et al.;H.Okamura et al.
通讯作者：
H.Okamura et al.

Alpha-C-Mannosyltryptophan is not recognized ・・・

α-C-甘露糖基色氨酸未被识别...

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
Bioorg.Med.Chem. 12
影响因子：
0
作者：
佐藤ちひろ;北島健;佐藤ちひろ;C.Sato;S.Miyata et al.;S.Asahina et al.;A.Fujita et al.;E.Y.Nikonova et al.;T.Nishikawa et al.
通讯作者：
T.Nishikawa et al.