腫瘍幹細胞マーカーＤｃｌｋ１を用いた大腸癌治療への発展

利用肿瘤干细胞标记物Dclk1开发结直肠癌治疗方法

基本信息

批准号：
13J02261
负责人：
中西祐貴
金额：
$ 1.77万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13J02261/
关键词：
消化管幹細胞抗体療法癌幹細胞 Dcamkll

项目摘要

人体を脅かす癌組織には少数の「腫瘍幹細胞」が存在し、癌の形成や発展にとどまらず、癌の治療抵抗性や転移にも関与していると考えられている。すなわち、現行の抗癌剤治療では一時的に癌が縮小しても、「腫瘍幹細胞」を除去しきれないために、癌の再発をきたすとされ、腫瘍幹細胞を標的とする治療法開発の必要性が高まっている。また、腫瘍幹細胞を特異的に標的とすることは、正常組織に副作用がない理想的な癌治療につながる可能性がある。これまでに申請者らは、マウス腸腫瘍モデルにおいてDclk1が腫瘍幹細胞の特異的マーカーであること、そしてDclk1を発現する腫瘍幹細胞を除去することで、正常組織に影響を及ぼすことなく腸腫瘍が退縮することを示してきた。本研究課題は、マウスモデルで認めた抗腫瘍効果をヒト癌にも適用するために、Dclk1を標的とした抗体医療および癌免疫療法の可能性を検討することである。Dclk1は大部分が細胞質内に存在するが、C末端部を細胞外に露出させていることに着目した。正常腸管において、Dclk1は大部分が細胞質内微小管領域に存在するとされるが、細胞外にC末端部位を露出させており、ソーティングが可能と報告されている(May R, Stem Cells, 2009)。そこでまず本年度は、C末端部に対するマウスモノクローナル抗体の作製に取り掛かった。マウスDclk1のC末端アミノ酸配列をコードするcDNAよりリコンビナントタンパクを合成した。そして、同リコンビナントタンパクにより免疫したマウスの膝窩リンパ節細胞を採取し、P3U1骨髄腫細胞と融合させることによりハイブリドーマを形成に成功した。得られたハイブリドーマをHAT培地で培養、選別し、クローン化を行った。親和性の高いクローンをELISA、ウエスタン・プロッティング法で選択し、ハイブリドーマ・クローンを樹立、モノクローナル抗体の作製に成功した。

癌症组织中有少数“肿瘤干细胞”威胁人体，它不仅参与了癌症的形成和发展，而且还参与了对癌症治疗和转移的抵抗。换句话说，即使目前的抗癌药物治疗暂时减少了癌症，据说癌症将无法一路去除，导致癌症复发，并且需要开发针对肿瘤干细胞的治疗方法。另外，特定的靶向肿瘤干细胞可能导致理想的癌症治疗，而在正常组织中无副作用。迄今为止，申请人表明DCLK1是小鼠肠道肿瘤模型中肿瘤干细胞的特定标记，并且去除表达DCLK1的肿瘤干细胞会导致肠道肿瘤的回归而不会影响正常组织。该研究主题是研究针对DCLK1的抗体医学和癌症免疫疗法的可能性，以便将在小鼠模型中观察到的抗肿瘤作用也应用于人类癌症。尽管DCLK1主要位于细胞质中，但注意到其C末端是细胞外暴露的。在正常的肠道中，据说DCLK1在很大程度上存在于胞质微管中，但它在细胞外暴露了C末端位点，并且据报道可以进行分类（May R，Stem Pells，2009）。因此，今年我们开始开发小鼠单克隆抗体的C末端部分。从编码小鼠DCLK1的C末端氨基酸序列的cDNA合成重组蛋白。然后，收集来自用相同重组蛋白免疫的小鼠的popliteal淋巴结细胞，并与P3U1骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤。将产生的杂交瘤培养在HAT培养基，分类和克隆中。使用ELISA或西部绘制方法选择了高度亲和力克隆，并建立了杂交瘤克隆，并成功产生了单克隆抗体。