Development of new therapy for urinary incontinence by mitophagy activation of urethral rhabdosphincter

通过尿道横纹括约肌线粒体自噬激活治疗尿失禁的新疗法

基本信息

批准号：
22K09532
负责人：
三股浩光
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Oita University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

外尿道括約筋は膜様部尿道を取り囲む横紋筋で、尿禁制に寄与しているが、加齢とともに脆弱化し、尿失禁の一因となる。本研究では、まず透過型電子顕微鏡によるヒト外尿道括約筋の異常ミトコンドリアの蓄積を検討し、異常ミトコンドリアの除去機構であるマイトファジーについて検討を行った。インフォームド・コンセントの得られた膀胱全摘症例より、手術時に外尿道括約筋組織と腹直筋組織を採取し、電子顕微鏡標本作成及び分子学実験用に処理を行った。組織学的実験は両組織を2％グルタールアルデヒド固定液で保存し電子顕微鏡ブロックを作成した。また分子生物学的実験用に、採取した組織をディープ・フリーザーにて保存した。組織学的実験はこれまでに7例の電子顕微鏡標本を作製した。2例については外尿道括約筋組織と腹直筋組織の透過型電子顕微鏡写真が得られており、外尿道括約筋組織は腹直筋組織と比べて、筋束に隙間が多く、ミトコンドリア数の減少や空洞化・膨化を認め異常ミトコンドリアの蓄積が示唆された。また筋線維別に外尿道括約筋におけるミトコンドリア異常についても観察された。また細胞学実験では膀胱全摘症例より、手術時に外尿道括約筋組織外尿道括約筋の微量組織を細切し、コラゲナーゼ処理後に初代培養を行った。分離培養した外尿道括約筋幹細胞にCSII-CMV-CDK4R24C、CSII-CMV-cyclin D1 及びCSII-CMV-TERTを遺伝子導入した。さらに横紋筋幹細胞マーカーであるCD56（NCAM）に対する蛍光抗体を用いてフローサイトメーターによって横紋筋幹細胞を分離し長寿化細胞株を樹立した。これまでに8例の外尿道括約筋組織の初代培養を行っており、4例に長寿化遺伝子を導入して3例の長寿化細胞株を樹立した。これらの細胞株について分化・増殖実験を行い横紋筋に分化することを確認した。

外部尿道括约肌是围绕膜尿道的横纹肌肉，这有助于尿道禁忌症，但随着年龄的增长而变得更加脆弱，导致尿失禁。在这项研究中，我们首先检查了使用透射电子显微镜在人外部尿道括约肌中异常线粒体的积累，并检查了线粒体，这是一种去除异常线粒体的机制。从通过知情同意书获得的总膀胱切除术病例中，在手术期间收集了外部尿道括约肌和腹部腹肌组织，并进行了电子显微镜样品制备和分子实验的处理。在组织学实验中，将两个组织都存储在2％的戊二醛固定剂中，以创建电子显微镜块。同样，对于分子生物学实验，将收集的组织存储在深冰箱中。到目前为止，组织学实验已经产生了七个电子显微镜标本。 Transmission electron micrographs of external urethral sphincter tissue and rectus abdominis tissue were obtained for the two cases, and compared to the rectus abdominis tissue, the external urethral sphincter tissue had more spaces in the muscle bundle than the rectus abdominis tissue, resulting in a decrease in the number of mitochondria, hollowing out and swelling, which suggested the accumulation of abnormal线粒体。根据肌肉纤维化，还观察到外部尿道括约肌的线粒体异常。此外，在细胞学实验中，在总膀胱切除术的情况下，手术期间的外部括约肌组织的痕量组织被细切割，并且在胶原酶处理后进行了原发性培养。用CSII-CMV-CDK4R24C，CSII-CMV-CYCLIN D1和CSII-CMV-TERT转染分离的和培养的外尿道括约肌干细胞。此外，使用针对CD56（NCAM）的荧光抗体，横纹干细胞标记物，通过流式细胞仪分离纹理的干细胞，并建立了寿命细胞系。迄今为止，已经对八例外尿道括约肌组织进行了主要培养，并引入了四例病例以建立三个寿命细胞系。这些细胞系被分化和增殖实验，并证实它们分化为横纹肌肉。