RAN翻訳を抑制するRGq核酸の開発研究

抑制RAN翻译的RGq核酸的研发

• 批准号: 22K07366
• 负责人: 石黒 太郎
• 金额: $ 0.25万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07366/
• 关键词: G quadruplex; 核酸医薬; 神経変性疾患

本研究はRAN翻訳開始地点より上流配列にRGqを誘起することが出来れば，RAN翻訳蛋白の発現量を抑制することが可能となるのではないか考え、RGqを誘導する手段としてDNAorigamiを応用することから着想した。そこで本研究にて明らかにしようとする第一段階ではSCA31(TGGAAリピート、本邦で高頻度)、C9orf72-ALS/FTD(GGGGCCリピート、世界で高頻度)の２疾患に対してRGq核酸を設計し、すでに作成した疾患モデル培養細胞を用いてRAN翻訳抑制効果の高い核酸配列を決定することである。2022年度はSCA31において疾患リピートの上流に位置する複数のGGG配列を標的とし、RAN翻訳を抑制するRGq核酸をスクリーニングした。RGq核酸を複数デザインし、in vitroにおいていずれもデザインした核酸のチオフラビンを用いたG-quadruplex形成評価およびStop assayによる標的RNA上でのRGq形成を確認した。具体的には、SCA31のBEAN1のイントロン内のUGGAAリピートを含む領域の5'側に２０塩基前後でハイブリダイズするASOをデザインした。加えてこのASOにG-rich配列をテザリングした核酸を合成し、目的の標的RNA上のGGG配列上でG-quadruplexが形成されたことが確認された。またRAN翻訳についても培養細胞を用いた系にimmunoblotにより評価してタンパク発現抑制を確認した。今後ははさらなる①核酸配列の最適化、②化学修飾の最適化が必要であるが、現段階ではFISHによるRNA fociの評価も実施検討中である。

这项研究认为，如果可以从翻译开始开始以上上游诱导RGQ，则可以抑制RAN Translation蛋白的表达水平，并且我们提出了将Dnaorigami作为诱导RGQ的手段的想法。因此，在这项研究中澄清的第一步是为两种疾病设计RGQ核酸：SCA31（TGGAA重复，日本高频）和C9orf72-Als/ftd（GGGGCC重复，世界上的GGGGCC重复，高频），并确定使用该疾病模型的高RAN翻译抑制效应的核酸序列。在2022年，SCA31针对疾病重复上游的多个GGG序列，并筛选了抑制RAN翻译的RGQ核酸。设计了多种RGQ核酸，并使用硫非黄素（两者都设计的核酸，并通过Stop RNA在靶标RNA上进行了核酸，通过Stop分析确认了体外，G-四链体的形成。具体而言，ASO被设计为杂交与SCA31 BEAN1内含子内的uggaa重复的区域的5'侧，约20个基部。此外，将与富含G的序列束缚的核酸合成到该ASO中，并证实在目标RNA的GGG序列上形成了G Quadruplex。此外，还使用培养细胞在系统上使用免疫印迹评估了RAN翻译，以确认抑制蛋白质表达。将来，必须进一步优化核酸序列和2。化学修饰的优化是必要的，但是在此阶段，还研究了使用鱼类对RNA焦点的评估。