RAN翻訳を抑制するRGq核酸の開発研究

抑制RAN翻译的RGq核酸的研发

• 批准号: 22K07366
• 负责人: 石黒 太郎
• 金额: $ 0.25万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07366/
• 关键词: G quadruplex; 核酸医薬; 神経変性疾患

本研究はRAN翻訳開始地点より上流配列にRGqを誘起することが出来れば，RAN翻訳蛋白の発現量を抑制することが可能となるのではないか考え、RGqを誘導する手段としてDNAorigamiを応用することから着想した。そこで本研究にて明らかにしようとする第一段階ではSCA31(TGGAAリピート、本邦で高頻度)、C9orf72-ALS/FTD(GGGGCCリピート、世界で高頻度)の２疾患に対してRGq核酸を設計し、すでに作成した疾患モデル培養細胞を用いてRAN翻訳抑制効果の高い核酸配列を決定することである。2022年度はSCA31において疾患リピートの上流に位置する複数のGGG配列を標的とし、RAN翻訳を抑制するRGq核酸をスクリーニングした。RGq核酸を複数デザインし、in vitroにおいていずれもデザインした核酸のチオフラビンを用いたG-quadruplex形成評価およびStop assayによる標的RNA上でのRGq形成を確認した。具体的には、SCA31のBEAN1のイントロン内のUGGAAリピートを含む領域の5'側に２０塩基前後でハイブリダイズするASOをデザインした。加えてこのASOにG-rich配列をテザリングした核酸を合成し、目的の標的RNA上のGGG配列上でG-quadruplexが形成されたことが確認された。またRAN翻訳についても培養細胞を用いた系にimmunoblotにより評価してタンパク発現抑制を確認した。今後ははさらなる①核酸配列の最適化、②化学修飾の最適化が必要であるが、現段階ではFISHによるRNA fociの評価も実施検討中である。

在这项研究中，我们假设如果RGq可以在RAN翻译起始位点上游的序列中被诱导，那么就有可能抑制RAN翻译蛋白的表达水平，并且我们应用DNA折纸作为诱导RGq的手段。的想法由此而来。因此，在本研究的第一步中，我们设计了两种疾病的RGq核酸：SCA31（TGGAA重复序列，在日本常见）和C9orf72-ALS/FTD（GGGGCC重复序列，在世界范围内常见），目标是确定核酸。使用已经创建的疾病模型培养细胞，可以高效抑制 RAN 翻译的酸序列。 2022年，我们针对SCA31中疾病重复上游的多个GGG序列，筛选出抑制RAN翻译的RGq核酸。我们设计了多种 RGq 核酸，并使用硫代黄素在体外评估了每种设计核酸的 G-四链体形成，并使用 Stop 测定确认了靶 RNA 上的 RGq 形成。具体来说，我们设计了一个 ASO，它与 SCA31 的 BEAN1 内含子中包含 UGGAA 重复的区域的 5' 侧杂交约 20 个碱基。另外，合成了与该ASO连接的富含G序列的核酸，并证实在所需靶RNA上的GGG序列上形成了G四联体。此外，在使用培养细胞的系统中通过免疫印迹评估RAN翻译，并确认了蛋白质表达的抑制。未来还需要进一步（1）优化核酸序列和（2）优化化学修饰，但现阶段我们也在考虑通过FISH评估RNA焦点。