Calpain３変異による肢帯型筋ジストロフィーの発症メカニズムの解明

阐明 Calpain3 突变引起的肢带型肌营养不良症的发病机制

基本信息

批准号：
22K07014
负责人：
久恒智博
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07014/
关键词：
骨格筋筋ジストロフィーカルパインカルシウム

项目摘要

肢帯型筋ジストロフィーR1 (limb-girdle muscular dystrophy R1: LGMDR1)は、カルシウム依存性プロテアーゼのCalpain3を原因遺伝子とする進行性の筋ジストロフィーである。現在までに治療法は確立しておらず、LGMDR1の治療法の確立のためにもLGMDR1発症機序の解明は重要と考えられる。近年Calpain3を欠損したマウス(CAPN3KO)で筋小胞体のカルシウム貯蔵量が減少することが報告された。さらに、筋小胞体のカルシウム貯蔵量の減少がCalpain3の活性中心変異体のノックインマウス(C129S-KI)ではみられないことが明らかになった。このことから、Calpain3は酵素活性に依存しないメカニズムにより、筋小胞体カルシウム貯蔵量を制御することが考えられる。小胞体カルシウム貯蔵量の減少は細胞にとってストレスであるため、筋ジストロフィー発症機構に深い関わりがあると予想し、本研究ではCalpain3が筋小胞体カルシウム貯蔵量を制御する機構を明らかにすることを目指した。まず、本年度はCalpain3-WT, KO, KIマウス骨格筋より筋幹細胞を酵素処理法により取得し、in vitroで筋細胞に分化させ、筋細胞内のカルシウム動態を蛍光カルシウム指示薬により測定した。刺激はカルシウムポンプ阻害剤により行った。また、様々なCalpain3変異体を発現するプラスミドを構築し、HEK293細胞やCOS細胞、培養筋細胞においてその発現を確認した。

肢带型肌营养不良症 R1 (LGMDR1) 是一种由钙依赖性蛋白酶 Calpain3 引起的进行性肌营养不良症。迄今为止尚未建立治疗方法，并且为了建立 LGMDR1 的治疗方法，阐明 LGMDR1 的发病机制被认为很重要。最近，据报道，Calpain3 缺陷小鼠 (CAPN3KO) 肌浆网中的钙储存减少。此外，在Calpain3活性中心突变敲入小鼠（C129S-KI）中未观察到肌浆网中钙储存量的减少。这表明 Calpain3 通过不依赖于酶活性的机制控制肌浆网钙储存。由于内质网钙储存的减少对细胞来说是一种应激，因此我们预计它与肌营养不良症的发病机制密切相关。在本研究中，我们旨在阐明 Calpain3 控制肌浆网钙储存的机制。首先，今年，我们通过酶处理从 Calpain3-WT、KO 和 KI 小鼠的骨骼肌中获得肌肉干细胞，在体外将其分化为肌肉细胞，并使用荧光钙指示剂测量肌肉细胞内的钙动态。用钙泵抑制剂进行刺激。我们还构建了表达各种 Calpain3 突变体的质粒，并证实了它们在 HEK293 细胞、COS 细胞和培养的肌肉细胞中的表达。