新規構造・基質に基づく細菌S2P膜内切断プロテアーゼの切断制御機構の酵素学的理解

基于新结构和底物的细菌S2P膜内裂解蛋白酶裂解控制机制的酶学理解

基本信息

批准号：
22K06142
负责人：
檜作洋平
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究は、大腸菌膜内切断プロテアーゼRsePを研究対象とし、申請者らが新たに明らかにした新規立体構造や新規切断基質群に基づいて生化学的・遺伝学的・酵素学的解析を行うことで、膜内切断の基質認識・切断機構の分子的理解を得るとともに、多様な基質の基質特異性を生み出す普遍的原理を理解することで、膜内切断の特異的制御を介した新規薬剤開発の分子基盤を構築することを目的とする。本年度は研究実施計画に基づいて研究を行い、以下の成果を得た。■RsePの新規X線結晶構造に基づく機能制御機構の解析：大腸菌RsePと阻害剤Batimastatとの複合体構造を基に変異体機能解析や阻害剤感受性アッセイを行い、阻害剤作用機序及び基質結合様式を明らかにした。また、異種の細菌RsePホモログとの立体構造比較に基づいた変異解析や修飾実験によるドメイン構造解析からRsePがゲート様構造を保有することを示し、さらに分子内架橋によりゲートの構造変化を制限すると基質切断能が低下したことから、このゲートの可動性が効率的な基質切断に重要であることを示した。これらの結果から、基質取り込み時にゲート構造が開閉することで、基質の触媒部位への提示及び切断を制御するというRsePの新たな切断制御モデルを提案した。これらの成果を論文にまとめ、学術雑誌Science Advances上で発表した。■新規切断基質群を用いた系統的切断解析：新規基質を含む25種の基質群の切断効率を同一条件で定量化できる解析系を構築し、これらの切断効率を比較した所、基質の膜貫通・膜外配列や長さ等の特徴と切断効率の間には明確な相関が見られないことを示した。さらに基質の系統的な変異解析・スワッピング解析を行い、基質の膜外領域の配列がRsePによる特異的な認識及び効率的な切断に影響を与えることを示唆する結果を得た。

这项研究的目的是通过基于新的3D结构和申请人揭示的新的切割底物进行生化，遗传和酶学分析来开发新药的分子基础，并通过对各种底物的理解，通过理解各种底物的底物特异性，从而揭示了生化，遗传和酶促分析。今年，根据研究实施计划进行了研究，并获得了以下结果。 ■对RSEP的新型X射线晶体结构进行了功能控制机制的分析：基于大肠杆菌RSEP的复杂结构和抑制剂Batimastat，突变函数分析和抑制剂敏感性测定法，以阐明抑制剂作用和底物结合模式的机制。此外，基于该结构与异源细菌RSEP同源物和域结构分析的结构比较的突变分析表明，RSEP具有类似栅极的结构，此外，限制了闸门的结构变化，通过内分子交叉连接减少了缩减的裂解能力，这表明了该闸门有效地提高了该闸门的功能。从这些结果中，我们提出了一种新的RSEP切割控制模型，其中栅极结构在底物摄取时打开并关闭，从而控制了底物对催化位点的呈现和切割。这些结果被编译成论文，并在《学术杂志科学进步》中提出。 ■ Systematic cleavage analysis using a new cleavage substrate group: An analysis system that can quantify the cleavage efficiency of 25 substrate groups including new substrates under the same conditions was constructed, and when comparing these cleavage efficiencies, it was shown that no clear correlation was found between the characteristics of the substrate, such as transmembrane and extramembrane arrangement and length, and the cleavage efficiency.此外，对底物进行了系统的突变分析和交换分析，结果表明底物的外膜外区域的序列会影响RSEP的特定识别和有效的裂解。