新規構造・基質に基づく細菌S2P膜内切断プロテアーゼの切断制御機構の酵素学的理解

基于新结构和底物的细菌S2P膜内裂解蛋白酶裂解控制机制的酶学理解

基本信息

批准号：
22K06142
负责人：
檜作洋平
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究は、大腸菌膜内切断プロテアーゼRsePを研究対象とし、申請者らが新たに明らかにした新規立体構造や新規切断基質群に基づいて生化学的・遺伝学的・酵素学的解析を行うことで、膜内切断の基質認識・切断機構の分子的理解を得るとともに、多様な基質の基質特異性を生み出す普遍的原理を理解することで、膜内切断の特異的制御を介した新規薬剤開発の分子基盤を構築することを目的とする。本年度は研究実施計画に基づいて研究を行い、以下の成果を得た。■RsePの新規X線結晶構造に基づく機能制御機構の解析：大腸菌RsePと阻害剤Batimastatとの複合体構造を基に変異体機能解析や阻害剤感受性アッセイを行い、阻害剤作用機序及び基質結合様式を明らかにした。また、異種の細菌RsePホモログとの立体構造比較に基づいた変異解析や修飾実験によるドメイン構造解析からRsePがゲート様構造を保有することを示し、さらに分子内架橋によりゲートの構造変化を制限すると基質切断能が低下したことから、このゲートの可動性が効率的な基質切断に重要であることを示した。これらの結果から、基質取り込み時にゲート構造が開閉することで、基質の触媒部位への提示及び切断を制御するというRsePの新たな切断制御モデルを提案した。これらの成果を論文にまとめ、学術雑誌Science Advances上で発表した。■新規切断基質群を用いた系統的切断解析：新規基質を含む25種の基質群の切断効率を同一条件で定量化できる解析系を構築し、これらの切断効率を比較した所、基質の膜貫通・膜外配列や長さ等の特徴と切断効率の間には明確な相関が見られないことを示した。さらに基質の系統的な変異解析・スワッピング解析を行い、基質の膜外領域の配列がRsePによる特異的な認識及び効率的な切断に影響を与えることを示唆する結果を得た。

本研究将重点关注大肠杆菌膜内裂解蛋白酶RseP，并基于申请人新揭示的新3D结构和新裂解底物基团进行生化、遗传和酶学分析，获得对底物识别和裂解的分子认识。了解膜内裂解的裂解机制并了解各种底物产生底物特异性的普遍原理，我们将能够通过膜内裂解的特异性控制来开发新药物。今年，我们根据研究实施方案进行了研究，取得了以下成果。 ■基于RseP新型X射线晶体结构的功能调控机制分析：基于大肠杆菌RseP与抑制剂Batimastat的复合结构，我们进行了突变体功能分析和抑制剂敏感性测定，并研究了抑制剂的作用机制和底物结合的格式已得到澄清。此外，基于与异源细菌RseP同源物的三级结构比较的突变分析和基于修饰实验的结构域结构分析表明，RseP具有门状结构，而且，如果门的结构变化受到分子内交联的限制，衬底裂解能力下降，表明该栅极的迁移率对于有效的衬底裂解很重要。基于这些结果，我们提出了一种新的 RseP 裂解控制模型，其中底物向催化位点的呈现和底物的裂解是通过底物摄取时打开和关闭栅极结构来控制的。这些结果总结在一篇论文中，并发表在学术期刊《科学进展》上。 ■使用一组新型裂解底物进行系统裂解分析：我们构建了一个分析系统，可以在相同条件下定量包括新底物在内的 25 种底物的裂解效率，并比较这些裂解效率。穿透/膜外序列等特征与长度和切割效率之间没有明确的相关性。此外，我们对底物进行了系统的突变分析和交换分析，结果表明底物膜外区域的序列影响RseP的特异性识别和有效切割。