超分子ナノマシン細菌べん毛モーターを再構成して機能を探る

超分子纳米机器重建细菌鞭毛马达并探索其功能

基本信息

批准号：
07J02549
负责人：
檜作洋平
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J02549/
关键词：
大腸菌べん毛モーター Pリング固定子複合体ジスルフィド架橋ペプチドグリカンキメラタンパク質外膜リポタンパク質超分子ナノマシン機能的再構成固定子タンパク質システインスキャニングシステインクロスリンク

项目摘要

細菌のべん毛モーターは運動器官としては生物最小の転モーターである。本研究の目的はべん毛基部体構成因子であるPリングと固定子タンパク質MotBを架橋させることで固定子を回転子とともに単離し、完全な状態のべん毛モーターを単離・再構成することである。昨年度の研究によってPリングを構成するFlgIとMotB間のジスルフィド架橋をタンパク質レベルで確認するところまで達成した。本年度の研究では、さらに架橋方法の探索を推し進め、菌の運動能を損なうことなくFlgIとMotBを架橋する方法を見出した。また、検出された架橋の一部はべん毛に組み込まれたPリングと固定子の間での架橋を反映していることを示唆する結果を得た。これらの結果は、本研究の目的である固定子付きのべん毛モーターの単離に大きく近づくものであり、さらに今まで推測の域を出なかったPリングと固定子の間の相互作用の存在を示唆する初めてのデータである。これと並行して、FlgIとの架橋が確認されたMotB C末端領域のPGBドメインの機能・構造解析を行った。MotBのC末端PGB領域を他の3種のPGBタンパク質のPGB領域と切り換えたキメラMotBを作製し、MotBとしての機能を調べた。作製したキメラMotBは機能しなかったが、キメラ発現株から運動能復帰変異体の取得を試みたところ、外膜リポタンパク質Palとのキメラから、P159L、F172Vという2種の運動能復帰変異体を取得した。F172V変異はPGとの結合能には変化を与えなかったことから、MotBとPalのPGB領域はPG結合能という点で機能的に互換性があることが示された。さらにMotB変異体とPalの立体構造との比較から、MotBとPalのPGB領域の構造的な類似性も示唆された。

细菌鞭毛运动是生物体中最小的运动运动。本研究的目的是通过交联鞭毛基体的组成部分P环和定子蛋白MotB来分离定子和转子，并分离和重建完整的鞭毛马达。通过去年的研究，我们能够在蛋白质水平上确认FlgI和MotB之间构成P环的二硫键。在今年的研究中，我们进一步探索了交联方法，找到了一种在不损害细菌运动性的情况下交联FlgI和MotB的方法。我们还获得的结果表明，一些检测到的交联反映了纳入鞭毛和定子的 P 环之间的交联。这些结果使我们更接近于鞭毛电机与定子的隔离，这是本研究的目标，并进一步证实了 P 环和定子之间相互作用的存在，到目前为止，这一直是一个问题这是第一个表明这一点的数据。同时，我们对 MotB C 端区域的 PGB 结构域进行了功能和结构分析，证实其与 FlgI 交联。通过将 MotB 的 C 端 PGB 区域与其他三种 PGB 蛋白的 PGB 区域交换来创建嵌合 MotB，并研究了其作为 MotB 的功能。制备的嵌合体MotB没有功能，但是当我们试图从嵌合体表达菌株中获得运动回复体时，我们发现从具有外膜脂蛋白Pal的嵌合体中获得了两种类型的运动回复体：P159L和F172V。 F172V突变没有改变PG结合能力，表明MotB和Pal的PGB区域在PG结合能力方面功能兼容。此外，MotB 突变体和 Pal 的三维结构的比较表明 MotB 和 Pal 的 PGB 区域之间的结构相似性。