イバラキウイルス感染における相補現象の分子基盤とウイルス生存戦略

茨城病毒感染互补现象的分子基础及病毒生存策略

基本信息

批准号：
22K05986
负责人：
松尾栄子
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本年度はまず、先行研究で観察された赤色蛍光タンパク質mCherry遺伝子を挿入したイバラキウイルス（IBAV）をハムスター腎臓由来細胞（BSR細胞）で継代すると生じる欠失パターンについて解析を進めた。先行研究では、RT-PCR産物をクローニングして解析を行なっていたため、プライマーが結合する領域が変異した株を解析することができなかった。また、RNAを細胞から抽出したため、ウイルス粒子中に取り込まれたRNAであるかは不明であった。そこで、感染細胞だけでなくその培養上清中からもRNAを抽出し、現在MiSeqで解析中である。また、mCherry遺伝子の欠失が起こる機序を解明するため、先行研究で得られた欠失パターンをもとにRNA二次構造を解析し、IBAV RdRpが読み飛ばしてしまう異常な対合の探索を開始した。さらに、各継代ウイルス集団の増殖性を細胞変性効果（CPE）とmCherryの蛍光に基づくフォーカスで解析したところ、CPEから算出されるウイルス力価がフォーカスから算出される力価を上回る前には欠失によって複製能を失ったIBAVが大量に生じることを示唆するデータを得た。次に野生型IBAVと緑色蛍光タンパク質eGFP遺伝子、もしくはUnaG遺伝子を挿入したIBAVをシマカ由来細胞（C6/36細胞）で継代した。UnaG遺伝子を挿入したIBAVはC6/36細胞でウイルスゲノム複製およびタンパク質合成は行われたがUnaGの蛍光を観察することができず、ビリルビン結合タンパク質であるUnaGは昆虫細胞でのIBAV感染の可視化には不適であることが明らかとなった。野生型もしくはeGFP遺伝子挿入IBAVは継代が進むとC6/36細胞によりCPEを起こすようになった。現在、増殖性ならびにRNA組成の解析に向けて準備中である。また、IBAVの特性をより理解するため、同属のウイルスの解析も試みた。

今年，我们首先分析了先前研究中观察到的缺失模式，即含有红色荧光蛋白 mCherry 基因的茨城病毒 (IBAV) 在仓鼠肾源性细胞（BSR 细胞）中传代时发生的缺失模式。在之前的研究中，RT-PCR产物被克隆和分析，因此不可能分析引物结合区域发生突变的菌株。此外，由于RNA是从细胞中提取的，因此尚不清楚它是否是整合到病毒颗粒中的RNA。因此，RNA 不仅从感染细胞中提取，还从其培养上清液中提取，目前正在使用 MiSeq 进行分析。此外，为了阐明mCherry基因缺失发生的机制，我们将根据之前研究中获得的缺失模式分析RNA二级结构，并寻找被IBAV RdRp跳过的异常配对。此外，当我们使用基于细胞病变效应（CPE）和 mCherry 荧光的焦点分析每个传代病毒群体的生长潜力时，我们发现，在根据 CPE 计算的病毒滴度超过根据焦点计算的滴度之前，我们获得的数据表明缺失产生大量 IBAV 失去了复制能力。接下来，将野生型IBAV和已插入绿色荧光蛋白eGFP基因或UnaG基因的IBAV在条纹蚊来源的细胞(C6/36细胞)中传代培养。插入UnaG基因的IBAV在C6/36细胞中进行病毒基因组复制和蛋白质合成，但未观察到UnaG荧光。随着野生型或插入 eGFP 基因的 IBAV 传代，C6/36 细胞开始引起 CPE。我们目前正在准备分析增殖和 RNA 组成。此外，为了更好地了解IBAV的特征，我们还尝试对同属病毒进行分析。