イバラキウイルス感染における相補現象の分子基盤とウイルス生存戦略

茨城病毒感染互补现象的分子基础及病毒生存策略

基本信息

批准号：
22K05986
负责人：
松尾栄子
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本年度はまず、先行研究で観察された赤色蛍光タンパク質mCherry遺伝子を挿入したイバラキウイルス（IBAV）をハムスター腎臓由来細胞（BSR細胞）で継代すると生じる欠失パターンについて解析を進めた。先行研究では、RT-PCR産物をクローニングして解析を行なっていたため、プライマーが結合する領域が変異した株を解析することができなかった。また、RNAを細胞から抽出したため、ウイルス粒子中に取り込まれたRNAであるかは不明であった。そこで、感染細胞だけでなくその培養上清中からもRNAを抽出し、現在MiSeqで解析中である。また、mCherry遺伝子の欠失が起こる機序を解明するため、先行研究で得られた欠失パターンをもとにRNA二次構造を解析し、IBAV RdRpが読み飛ばしてしまう異常な対合の探索を開始した。さらに、各継代ウイルス集団の増殖性を細胞変性効果（CPE）とmCherryの蛍光に基づくフォーカスで解析したところ、CPEから算出されるウイルス力価がフォーカスから算出される力価を上回る前には欠失によって複製能を失ったIBAVが大量に生じることを示唆するデータを得た。次に野生型IBAVと緑色蛍光タンパク質eGFP遺伝子、もしくはUnaG遺伝子を挿入したIBAVをシマカ由来細胞（C6/36細胞）で継代した。UnaG遺伝子を挿入したIBAVはC6/36細胞でウイルスゲノム複製およびタンパク質合成は行われたがUnaGの蛍光を観察することができず、ビリルビン結合タンパク質であるUnaGは昆虫細胞でのIBAV感染の可視化には不適であることが明らかとなった。野生型もしくはeGFP遺伝子挿入IBAVは継代が進むとC6/36細胞によりCPEを起こすようになった。現在、増殖性ならびにRNA組成の解析に向けて準備中である。また、IBAVの特性をより理解するため、同属のウイルスの解析も試みた。

今年，我们首先分析了ibarakivirus（IBAV）在先前研究中观察到的红色荧光蛋白MCHERRY基因中的缺失模式（IBAV）在仓鼠肾脏衍生的细胞（BSR细胞）中传递。在先前的研究中，通过克隆RT-PCR产物进行了分析，因此不可能分析引物结合的区域突变的菌株。此外，由于从细胞中提取了RNA，因此尚不清楚是否是在病毒颗粒中占用的RNA。因此，不仅从感染的细胞，而且还从培养上清液中提取RNA，目前正在使用Miseq进行分析。此外，为了阐明MCHERRY基因缺失的机制，我们根据先前研究中获得的缺失模式分析了RNA二级结构，并开始搜索IBAV RDRP跳过的异常配对。此外，当使用基于细胞病毒效应（CPE）和MCHERRY荧光的重点分析每个传代病毒群体的增殖性能时，获得了数据，表明在从CPE中计算出病毒terter titer在CPE中计算出了超过copter titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer titer的复制能力都失去了大量的IBAV。接下来，将野生型IBAV和插入Unag基因的绿色荧光蛋白EGFP基因或IBAV基因被转移到灰分的细胞中（C6/36细胞）。尽管插入的unag基因的IBAV受到C6/36细胞中的病毒基因组复制和蛋白质的合成，但未观察到unag的荧光，并且发现Unag是一种胆红素 - 结合蛋白的Unag，不适合可视化昆虫细胞中的IBAV感染。通道后，野生型或EGFP基因插入IBAV成为C6/36细胞中的CPE。目前，正在制备用于分析增殖性质和RNA组成。此外，我们试图分析相同属的病毒，以更好地了解IBAV的特性。