難分解性環境汚染物質である有機リン化合物を完全無毒化する微生物を創出する

创造能够完全解毒有机磷化合物（持久性环境污染物）的微生物。

基本信息

批准号：
22K05202
负责人：
阿部勝正
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Hakodate National College of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

Tris(2-chloroethyl) phosphateなどの塩素を含む有機リン化合物は，可塑剤や難燃材として世界各地で大量に用いられているが，難分解性であり，種々の毒性を有する．研究代表者はこれまで，含塩素有機リン化合物分解システム構築のため， TCEP分解菌 Sphingobium sp. TCM1を単離し，その分解メカニズムについて詳細に解析してきた．それら研究においてTCM1株はTCEPを分解し2-クロロエタノール(2-CE)と無機リン酸を最終産物として生成するが，2-CEを分解できないことが明らかになっている.この2-CEも毒性化合物であり， TCEPの完全無毒化を行うためには2-CEのさらなる分解が必要となる.本研究ではTCM1株に2-CE分解酵素遺伝子を導入・生産させることで，TCEPの完全無毒化が可能な新規菌株の創出を目的としている．令和4年度は以下の業績を上げた．2-CE分解酵素の生産調節因子として用いるため，TCM1のドラフトゲノムデータベースより構成的発現遺伝子としてよく知られている，グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素遺伝子プロモーターを同定した．同定したプロモーター領域遺伝子を受託により合成し，レポーター遺伝子であるlacZ遺伝子とオーバーラップPCR法により融合させた．また，同時にTCM1ホスホトリエステラーゼ遺伝子（had遺伝子）のプロモーター領域とlacZの融合遺伝子も同様に融合させ，両方の遺伝子をそれぞれ広域宿主ベクターであるpKT230MCベクターに挿入した．構築したベクターを導入したTCM1株を用いて，レポーターアッセイを試みたがTCM1株が元々有するLacZ活性が高く，今回検討した二つのプロモーターの能力については明らかにはならなかった．次年度は2-CE分解酵素であるhheC遺伝子を用いたプロモーターの解析を行う予定である．

磷酸三(2-氯乙基)酯等含氯有机磷化合物在世界范围内大量用作增塑剂和阻燃剂，但它们难以分解且具有多种毒性。目前，课题组分离出一株TCEP降解菌Sphingobium sp.，构建了氯化有机磷化合物的分解体系，并对其分解机理进行了详细分析。在这些研究中，发现TCM1菌株分解TCEP并产生2-氯乙醇(2-CE)和无机磷酸作为最终产物，但不能分解2-CE，它是一种有毒化合物。为了彻底解毒TCEP，需要进一步分解2-CE，在本研究中，我们将新的2-CE降解酶基因引入TCM1菌株中并产生菌株。 2020财年，我们取得了以下成绩。我们从 TCM1 基因组草图数据库中鉴定了众所周知的组成型表达基因 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子，以便将其用作 2-CE 降解酶的生产调节剂。根据要求合成鉴定出的启动子区基因，并利用重叠PCR方法与报告基因lacZ基因融合。同时，将TCM1磷酸三酯酶基因（had基因）的启动子区域与lacZ融合基因进行类似融合，并将这两个基因插入到pKT230MC载体中，该载体是一种广宿主范围载体。使用已导入构建载体的TCM1菌株尝试进行报告基因检测，但TCM1菌株固有的LacZ活性较高，并且此次检测的两个启动子的能力尚不清楚。明年，我们计划使用 hheC 基因（一种 2-CE 降解酶）来分析启动子。