難分解性環境汚染物質である有機リン化合物を完全無毒化する微生物を創出する

创造能够完全解毒有机磷化合物（持久性环境污染物）的微生物。

基本信息

批准号：
22K05202
负责人：
阿部勝正
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Hakodate National College of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

Tris(2-chloroethyl) phosphateなどの塩素を含む有機リン化合物は，可塑剤や難燃材として世界各地で大量に用いられているが，難分解性であり，種々の毒性を有する．研究代表者はこれまで，含塩素有機リン化合物分解システム構築のため， TCEP分解菌 Sphingobium sp. TCM1を単離し，その分解メカニズムについて詳細に解析してきた．それら研究においてTCM1株はTCEPを分解し2-クロロエタノール(2-CE)と無機リン酸を最終産物として生成するが，2-CEを分解できないことが明らかになっている.この2-CEも毒性化合物であり， TCEPの完全無毒化を行うためには2-CEのさらなる分解が必要となる.本研究ではTCM1株に2-CE分解酵素遺伝子を導入・生産させることで，TCEPの完全無毒化が可能な新規菌株の創出を目的としている．令和4年度は以下の業績を上げた．2-CE分解酵素の生産調節因子として用いるため，TCM1のドラフトゲノムデータベースより構成的発現遺伝子としてよく知られている，グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素遺伝子プロモーターを同定した．同定したプロモーター領域遺伝子を受託により合成し，レポーター遺伝子であるlacZ遺伝子とオーバーラップPCR法により融合させた．また，同時にTCM1ホスホトリエステラーゼ遺伝子（had遺伝子）のプロモーター領域とlacZの融合遺伝子も同様に融合させ，両方の遺伝子をそれぞれ広域宿主ベクターであるpKT230MCベクターに挿入した．構築したベクターを導入したTCM1株を用いて，レポーターアッセイを試みたがTCM1株が元々有するLacZ活性が高く，今回検討した二つのプロモーターの能力については明らかにはならなかった．次年度は2-CE分解酵素であるhheC遺伝子を用いたプロモーターの解析を行う予定である．

含有氯的有机磷化合物，例如Tris（2-氯乙基）磷酸盐，在世界各地都用作增塑剂和阻燃剂，但很难分解并且具有多种毒性。研究人员先前已经分离了TCEP降解细菌鞘磷脂。 TCM1构建一种用于降解含氯有机磷化合物的系统，并详细分析了其降解机制。这些研究表明，TCM1菌株会降解TCEP并产生2-氯乙醇（2CE）和无机磷酸盐作为最终产物，但不能降解2-CE。该2CE也是一种有毒化合物，需要进一步的2CE降解才能完全排毒TCEP。这项研究旨在创建一种新的菌株，该菌株可以通过在TCM1菌株中引入和产生2-CE降解酶基因来完全排毒TCEP。在2022年，我们获得了以下结果：用作2CE降解酶的生产调节剂，即3-磷酸甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子，该基因被众所周知，该基因已被鉴定为TCM1的基因组数据组草案。通过佣金合成了确定的启动子区域基因，并通过重叠PCR与记者基因LACZ基因融合。同时，TCM1磷酸二酯酶基因的启动子区域（HAD基因）和LACZ的融合基因均融合，并且两个基因都插入了大范围宿主载体载体PKT230MC载体中。我们尝试使用TCM1菌株进行了记者测定，该测定法已与构造的向量引入，但是TCM1菌株的原始LACZ活性很高，并且这次检查的两个启动子的能力尚不清楚。明年，我们计划使用HHEC基因（一种2CE降解酶）分析启动子。