イメージング技術を用いた骨伸展時の骨細胞動態と骨リモデリング制御の解析

利用成像技术分析骨延伸过程中的骨细胞动力学和骨重塑控制

基本信息

批准号：
22K10260
负责人：
岡安麻里
金额：
$ 2.66万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K10260/
关键词：
骨リモデリングイメージングメカニカルストレス

项目摘要

まず、伸展刺激装置における骨代謝細胞ネットワーク再現系の構築のために、ストレックス社のストレッチチャンバーに、全身の細胞が緑色蛍光タンパク質を発現するEGFPマウス頭頂骨より採取した骨芽細胞を播種し、培養した。細胞がコンフルエントになった日をDay0 とし、βGlycerophosphateおよびAscorbic acidを含む骨芽細胞分化培地での培養を開始した。約4週後に石灰化結節の形成を肉眼的に、および顕微鏡下で確認した。その後、マクロファージおよび破骨細胞が赤色蛍光タンパク質を発現するRANK-Cre xR26-tdTomatoマウス由来骨髄マクロファージを加え、活性型ビタミンD、プロスタグランジンE2を添加した培地にて共培養を開始した。以降、1週間ごとに同一部位をニコン2光子顕微鏡A1 MPで観察した。伸展の頻度や伸展率について検討した結果、1週間に1回、伸展率は週2.5%, 5.0%が、チャンパーの破綻を生じない条件であることを確認した。また、伸展以外の力学的負荷を加える方法として、遠心刺激を与える試みを行った。50万細胞/6 cm dish相当でEGFPマウス由来骨芽細胞を播種し、分化培養を4週間行った後にRANK-Cre xR26-tdTomatoマウス由来骨髄マクロファージとの共存培養を開始した。その後再びβGlycerophosphateおよびAscorbic acidを含む骨芽細胞分化培地に切り替え、遠心（1回30分，週3回　20 G, 200 G, 2000 G）を加えた。以降、1週間ごとに同一部位をニコン2光子顕微鏡A1 MPで観察した。

首先，为了在拉伸刺激装置中构建骨代谢细胞网络复制系统，将从全身细胞表达绿色荧光蛋白的EGFP小鼠的顶骨收集的成骨细胞接种在Strex拉伸室中进行培养。将细胞汇合的那一天指定为第0天，并开始在含有β甘油磷酸和抗坏血酸的成骨细胞分化培养基中培养。大约4周后，肉眼和显微镜下证实钙化结节的形成。此后，添加源自巨噬细胞和破骨细胞表达红色荧光蛋白的RANK-Cre xR26-tdTomato小鼠的骨髓巨噬细胞，并在补充有活化维生素D和前列腺素E2的培养基中开始共培养。此后，每周使用尼康双光子显微镜A1 MP观察同一部位。通过检查延长频率和延长率，确认每周一次、每周2.5%和5.0%的延长率是不会导致试验机失败的条件。我们还尝试应用离心刺激作为施加机械载荷而不是延伸的方法。将EGFP小鼠来源的成骨细胞以相当于500,000个细胞/6cm培养皿接种，分化培养4周后，开始与RANK-Cre xR26-tdTomato小鼠来源的骨髓巨噬细胞共培养。此后，再次更换含有β-甘油磷酸和抗坏血酸的成骨细胞分化培养基，并添加离心(每次30分钟，每周3次，20G、200G、2000G)。此后，每周使用尼康双光子显微镜A1 MP观察同一部位。