ヒト末梢神経系のin vitro再構成系の構築による痛み緩和メカニズムの解明

构建人周围神经系统体外重建系统阐明疼痛缓解机制

基本信息

批准号：
21K19927
负责人：
岡浩太郎
金额：
$ 4.08万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K19927/
关键词：
間葉系幹細胞神経分化誘導アストロサイトカルシウムイメージング神経細胞順化培地再生医療痛み緩和のメカニズム細胞外ATPイメージング Caイメージングオキシトシン歯髄幹細胞ヒト末梢神経系ケラチノサイト後根神経節バイオイメージング

项目摘要

間葉系幹細胞（MSCs）は、再生医療やヒト由来の神経ネットワークモデリングへの応用が期待されており、添加する化学物質とその因子の組み合わせ、様々な共培養系の構築により、MSCsの神経への分化が試みられている。しかし、培養期間が長いことや、共培養細胞の状態に大きく依存するという欠点がある。最近、Rho経路は、MSCsの神経分化に重要な役割を果たすことが知られてきた。Rhoキナーゼ（ROCK）阻害剤Y-27632の添加は、形態的に神経細胞様への大きな変化が見られるものの、βIII-tublinの発現量はほぼ変わらないことや、神経細胞的な機能変化も知られていない。そこで、ヒト歯髄幹細胞(hDPSCs)に着目し、従来の神経分化誘導方法を再検討することを目的とした。hDPSCsを用いて、神経細胞のマーカーであるβIII-tublin、神経前駆幹細胞のマーカーであるnestinの発現量とその比率を免疫化学染色により定量した。さらに、神経分化の機能的変化を調べるために、KClやグルタミン酸等に対するカルシウム応答も調べた。これらの実験結果をもとに、神経分化の程度を評価しながら最適培養条件を絞り込んだ。まず、ラットより分離した海馬神経細胞とhDPSCsの共培養を行った結果、海馬神経細胞は神経分化誘導能を有するが、それは培養条件に依存した。そこで海馬神経細胞やアストロサイトの順化培地を、培養日数を様々に変えて取得し、さらにそれを段階的に希釈するなどの、12の条件からより良い分化条件を抽出した。次に、βIII-tublinとnestinの発現量とその比率を比較し、4条件を選択した。カルシウム応答波形から、機能的分化の観点から2条件に絞り込んだ。最後に、ROCK阻害剤との組み合わせで、海馬神経細胞馴化培地とアストロサイト馴化培地からの神経細胞への分化は重畳的に作用することがわかった。

基于米利 - 叶的干细胞（MSC）预计将应用于再生医学和人类网络建模，并将化学物质的组合添加到其因子中，并将各种CO培养系统构建到MSC神经中正在尝试。但是，存在一个缺点，即培养期很长，并且在很大程度上取决于CO培养细胞的状态。最近，众所周知，RHO路线在MSC的紧张感中起着重要作用。 Rho激酶（岩石）抑制剂Y-27632的添加在神经细胞中具有显着变化，但是βIII-Tublin表达几乎是相同的，并且神经细胞功能变化却不是。因此，目的是专注于人浆干细胞（HDPSC）并重新考虑常规神经分化诱导方法。使用HDPSC，通过免疫化学染色来定量HESTIN标记，神经细胞标记和神经初步干细胞的Nestin标记的表达和比率。此外，为了检查神经分化的功能变化，还检查了钙对KCL和谷氨酸的反应。基于这些实验结果，最佳培养条件在评估神经紧张程度的同时缩小了。首先，由于河马和HDPSC的共同文化与大鼠分离，河马相对神经细胞具有神经衍生能力，取决于培养条件。因此，从12个条件中提取了更好的分化条件，例如通过以各种方式改变培养天数来改变培养天数，并逐渐稀释它。接下来，比较βIII-Tublin和Nestin的表达量与其比例，选择了四个条件。从功能分化的角度，将钙响应波形缩小到两个条件。最后，与岩石抑制剂的结合表明，与河马神经细胞的分化是构造培养基和可积极作用的星形胶质细胞的神经细胞的分化。