ES細胞の機能強化とその利用による人工多能性幹細胞の調製

ES细胞的功能增强及利用其制备诱导多能干细胞

• 批准号: 21K19905
• 负责人: 川本 卓男
• 金额: $ 4.08万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-07-09 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K19905/
• 关键词: ES細胞; 人工多能性幹細胞; 機能強化; 細胞融合; 人工多能性細胞

マウスES細胞の機能を強化するために、体細胞を初期化して人工多能性幹細胞（iPS細胞）樹立するために用いられる初期化4因子（Oct3/4, Sox2, Klf4, L-myc)を、レトロウィルスベクターを用いて、マウスES細胞（129Sv株）に導入した。感染したマウスES細胞の増殖能およびモルフォロジー、未分化マーカー遺伝子（Nanog）の発現状況を、元のES細胞と比較したところ、大きな変化は変化は見られなかった。また、マウスES細胞の機能を強化する方法として、細胞融合に着目して、まず、手始めに、マウスES細胞とマウス胎児線維芽細胞(MEF細胞）の細胞融合を試みてみた。交流（周波数：1 MHz、電圧：30 V）を20秒間流し、直流パルス（電圧：350 V、パルス間隔：30 μ秒）を3回かけてみたところ、交流によって、パールチェーンは形成できているようだったが、うまく細胞を融合することはできなかった。今後、さらなる条件検討が必要である。併せて、ES細胞の脱核を試みるために、マウスES細胞懸濁液にサイトカラシンBを添加し、Ficollを用いて濃度勾配遠心を試みた。サイトカラシンBの濃度として、1、5、10、25、40 μg/mlを用意し、Ficollの濃度濃度勾配は30、25、20、15、10 %の濃度を用いて作成したが、残念ながら、遠心機器トラブルによって実験を行うことができなくなった。修理に多額の費用が掛かるため、遠心分離による方法は、現在、実施できない状況にある。

为了增强小鼠ES细胞的功能，我们引入了四种重编程因子（Oct3/4、Sox2、Klf4、L-myc），用于重编程体细胞并建立诱导多能干细胞（iPS细胞）。使用逆转录病毒载体的细胞（129Sv 株）。当感染的小鼠ES细胞的增殖能力、形态和未分化标记基因(Nanog)的表达状态与原始ES细胞相比时，没有观察到重大变化。我们还关注细胞融合作为增强小鼠ES细胞功能的一种方法，并首次尝试了小鼠ES细胞和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF细胞）之间的细胞融合。当施加交流电(频率：1MHz，电压：30V)20秒并施加直流脉冲(电压：350V，脉冲间隔：30μsec)3次时，由于交流电而形成珍珠链。然而，细胞未能成功融合。未来还需要进一步考虑条件。同时，为了尝试ES细胞的去核，我们将细胞松弛素B添加到小鼠ES细胞悬浮液中并尝试使用Ficoll进行浓度梯度离心。制备了 1、5、10、25 和 40 μg/ml 的细胞松弛素 B 浓度，并使用 30、25、20、15 和 10% 的浓度创建了聚蔗糖浓度梯度，但不幸的是，由于离心设备，不再可能进行实验。由于维修成本高，离心分离方法目前并不实用。