糖尿病黄斑浮腫に対する閾値下レーザー治療のモニタリングマーカー確立

阈下激光治疗糖尿病黄斑水肿监测标志物的建立

基本信息

批准号：
21K12762
负责人：
周尾卓也
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Hokuriku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では，糖尿病黄斑浮腫の治療有効性をモニタリングできる分子マーカーとして，閾値下レーザーの標的分子と同調する細胞外液性因子を選別し，医用質量分析の多重反応モニタリング法に適用可能な候補を提案する．高分解能精密質量分析装置を利用して，ヒト網膜色素上皮のセクレトームをメタボロミクス法とプロテオミクス法によって探究している．ヒトiPS分化細胞を，透過膜に集密的に播種し，無血清培地中で40日間以上培養することで，敷石状で黒褐色の網膜色素上皮シートを調製した．臨床での高血糖値を想定したグルコース濃度の培地中で30日間以上培養することで，糖尿病モデル網膜色素上皮を調製した．閾値下レーザーの照射から12時間後まで，網膜色素上皮の培養上清液を，1時間毎に採取した．比較の対象を意図して，ブタ網膜色素上皮の培養を新たに開始した．培養上清中の代謝物を包括的に解析するために，高速液体クロマトグラフィーと連結した高分解能精密質量分析（四重極飛行時間型）装置でメタボロミクス法を実行した．細胞に共通する一次代謝を標的として，質量分析に供する培養上清の前処理条件（除タンパクや希釈倍率）と液体クロマトグラフィー条件を決定した．高分解能精密質量分析装置で検出した化合物に対して，多重反応モニタリングMRMのためのメソッド（プレカーサーイオンとそのプロダクトイオンの質量電荷比）を作成し，このメソッドを高感度高速質量分析（三連四重極型）装置に適用して，測定作業の効率化を図った．メタボロミクス法で得られた多変量データを，ウェブベースのMetaboAnalyst 5.0ソフトウェアを活用して，PCA主成分分析およびPLS部分的最小二乗回帰によって内容を分類した．

在这项研究中，我们选择了与亚阈值激光靶分子同步的细胞外体液因子作为分子标记，可以监测糖尿病黄斑水肿的治疗功效，并提出可以应用于多个反应监测方法进行医学质量分析的候选者。使用高分辨率的精度质谱仪，使用代谢组和蛋白质组学方法探索了人视网膜色素上皮的分泌。将人IP的分化细胞汇合在可渗透的膜中，并在无血清培养基中培养40天以上，以制备铺路样的深棕色视网膜色素上皮片。糖尿病模型视网膜色素上皮是通过在葡萄糖浓度的培养基中培养超过30天来制备的，这被认为是临床上高血糖。每小时从用亚阈值激光照射后12小时收集视网膜色素上皮的培养上清液。猪视网膜色素上皮的新鲜培养的目的是进行比较。为了全面分析培养上清液中的代谢产物，代谢组学方法是在高分辨率的精确质谱法（四极杆飞行时间类型）上进行的，并与高性能液相色谱进行了。使用细胞常见的一级代谢确定了对要进行质量分析的培养上清液的预处理条件（蛋白质去除和稀释比）和液相色谱条件。为通过高分辨率精确质谱仪检测到的化合物创建了一种用于多次反应监测MRM（前体离子质量与荷尔兰离子）的方法，并将此方法应用于高度敏感的高速质谱（三肢体类型）设备，以提高测量工作效率。通过PCA主成分分析对通过代谢组学获得的多变量数据进行了分类，并使用基于Web的Metaboanalyst 5.0软件进行部分最小二乘回归。