ナノポアDNAシーケンサーを応用したハイスループット結核菌遺伝子型別法の開発

利用纳米孔DNA测序仪开发高通量结核分枝杆菌基因分型方法

• 批准号: 21K12721
• 负责人: 村瀬 良朗
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: 公益財団法人結核予防会 結核研究所
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K12721/
• 关键词: 結核; VNTR; ナノポア; 結核菌; 遺伝子型別; ナノポアシーケンス; 遺伝子型別検査; VNTR法; ナノポアシークエンス

従来の結核菌遺伝子型別法(VNTR法)では、施設間で使用する解析装置に違いがあり、データの精度保証が難しい、多検体処理が困難なため低コスト化が難しい、菌株識別能が不十分である、などの課題がある。これらの課題を克服するため、一度に複数菌株のVNTR分析を簡便かつ安価に実施するための手法を確立する。2年目は、本研究課題の目的であるナノポア・VNTR法の確立を目指して、菌株選定、ゲノムDNA精製、ナノポア・シーケンス、ナノポア・VNTR法の評価を行った。菌株については、当初の研究目的に加えて薬剤感受性予測を同時に実施することを考慮し、多剤耐性結核菌を中心とした96株を選定した。これらについて、昨年度に確立されたナノポア・シークエンスに適したゲノムDNAの精製を行った。ナノポア・シークエンスについては、シークエンス精度が改善されたR10.4.1フローセルを用いたランを実施し、96株のデータ取得を完了した。ナノポア・VNTR法の評価については、従来法とナノポア・VNTR法の一致率を比較することで実施した。本邦あるいは国際的に使用されている32VNTR領域のうちの27領域の一致率は100%であり、5領域では一致率が81.4%から98.8%であった。2年目は、本研究で必要とされる大半のデータ取得を完了した。3年目は、2年目に取得されたデータについて詳細な解析を進め、ナノポア・VNTR法の精度向上とナノポア・シークエンスに基づく薬剤感受性予測精度の評価を実施する予定である。

传统的结核分枝杆菌基因分型方法（VNTR法），各设施间使用的分析设备存在差异，难以保证数据准确性，难以处理多个样本，难以降低成本，菌株鉴定能力不强。等问题。为了克服这些问题，我们将建立一种方法，可以轻松且廉价地同时对多种细菌菌株进行 VNTR 分析。第二年，我们进行了菌株筛选、基因组DNA纯化、纳米孔测序以及纳米孔/VNTR方法的评估，旨在建立纳米孔/VNTR方法，这也是本研究项目的目的。菌株方面，选择了96株，主要是耐多药结核杆菌，考虑到在原有研究目的的基础上同时进行药敏预测。为此，我们纯化了适用于去年建立的纳米孔测序的基因组DNA。在纳米孔测序方面，我们使用测序精度更高的R10.4.1流动池进行了运行，并完成了96个菌株的数据采集。通过比较传统方法和纳米孔/VNTR方法之间的一致率来进行纳米孔/VNTR方法的评价。日本或国际上使用的 32 个 VNTR 区域中，有 27 个域的一致率为 100%，其中 5 个域的一致率为 81.4% 至 98.8%。第二年，这项研究所需的大部分数据都完成了。第三年，我们计划对第二年获得的数据进行详细分析，提高纳米孔/VNTR方法的准确性，评估基于纳米孔测序的药敏预测的准确性。

项目成果

In vitro activity of tedizolid and linezolid against multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis: a comparative study using microdilution broth assay and genomics

• DOI: 10.1016/j.diagmicrobio.2022.115714
• 发表时间: 2022-05-18
• 期刊: DIAGNOSTIC MICROBIOLOGY AND INFECTIOUS DISEASE
• 影响因子: 2.9
• 作者: Aono, Akio;Murase, Yoshiro;Mitarai, Satoshi
• 通讯作者: Mitarai, Satoshi

Non-amplification nucleic acid detection with thio-NAD cycling

使用硫代 NAD 循环进行非扩增核酸检测

• DOI: 10.1016/j.mimet.2022.106647
• 发表时间: 2023
• 期刊: Journal of Microbiological Methods
• 影响因子: 2.2
• 作者: Yamura Sou;Kawada Naoki;Yamakado Shinnosuke;Kyosei Yuta;Watabe Satoshi;Yoshimura Teruki;Murase Yoshiro;Mitarai Satoshi;Ito Etsuro
• 通讯作者: Ito Etsuro

抗酸菌DNAクロロホルムビーズ破砕抽出法におけるビーズ量の影響

抗酸菌DNA氯仿珠粉碎提取法中珠量的影响

• 发表时间: 2021
• 作者: 細谷真紀子;下村佳子;大薄麻未;森重雄太;村瀬良朗;近松絹代;青野昭男;五十嵐ゆり子;山田博之;高木明子;御手洗聡
• 通讯作者: 御手洗聡

抗酸菌DNAクロロホルムビーズ破砕抽出法におけるビーズ径の影響

珠粒直径对抗酸菌DNA氯仿珠粉碎提取方法的影响

• 发表时间: 2021
• 作者: 下村佳子;細谷真紀子;大薄麻未;森重雄太;村瀬良朗;近松絹代;青野昭男;五十嵐ゆり子;高木明子;山田博之;御手洗聡
• 通讯作者: 御手洗聡