時期および組織特異的なプロテインノックダウンを可能とするデグロンシステムの開発

开发能够实现时间和组织特异性蛋白质敲低的降解决定子系统

• 批准号: 21K19188
• 负责人: 成瀬 智恵
• 金额: $ 4.08万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-07-09 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K19188/
• 关键词: デグロン; マウス; プロテインノックダウン

生体でのプロテインノックダウンは，2022年に我々のグループを含めたマウス生体への実装例３例が初めて報告され，現在も世界的に改良が進められており，将来的に広く使用される技術になると考えられる。しかしながら，現在のところ，特異性や効率に改良の余地がある。そこで，これらの問題点を克服する方法の開発を進めており，現在，サリドマイドアナログを用いた簡便なプロテインノックダウン法の開発を目指している。サリドマイドアナログは，タンパク質分解に関わるE3ユビキチンリガーゼの構成要素の１つであるCRBNへ結合し，本来基質とならない「ネオリガンド」の分解を誘導し，様々な薬理作用を示す。これまで，サリドマイド誘導体に反応するデグロンタグをEGFPに融合させた遺伝子発現ベクター，および，Creにより反転すると初めて機能的になるタグを組み込んだ遺伝子発現ベクターを細胞に導入して，タグの反転効率およびタンパク質ノックダウンの効果を評価してきた。デグロンタグをC末に組み込むと効率の良いノックダウンが可能となることが明らかになった。また，Creを作用させることによって，タグの反転は高効率で行われ，ノックダウンが起こることが明らかになった。これまでヒト細胞，または，CRBNをヒト化したマウス細胞を用いて実験を行ってきたが，マウス細胞においても機能するタグを開発したため，今後は，野生型マウスで機能するサリドマイドアナログを用いたノックダウン系を用いて研究を進める予定である。

在2022年，在包括我们的小组在内的小鼠生物体中，在2022年首次报道了活生物体中的蛋白质敲低例子，并且仍在全球范围内进行改进，并有望成为一项将来将在未来广泛使用的技术。但是，目前还有提高特异性和效率的空间。因此，我们正在开发一种克服这些问题的方法，目前旨在使用沙利度胺类似物开发一种简单的蛋白质敲低方法。沙利度胺类似物与CRBN结合，CRBN是参与蛋白水解的E3泛素连接酶的成分之一，并诱导最初不是底物的“ Neoligands”降解，并表现出各种药理作用。到目前为止，我们已经引入了一个基因表达载体，在该载体中，对沙利度胺衍生物反应的DEGRON标签与EGFP融合在一起，并且一个基因表达矢量融合了仅在CRE倒置时具有功能性的TAG的基因表达矢量，以评估TAG反转效率和蛋白质敲低的效果。已经揭示了将Degron标签纳入C末端可以有效敲低的。还揭示了通过应用CRE，标签反转以高效率进行，从而导致敲低。以前，已经使用具有人源性CRBN的人类细胞或小鼠细胞进行了实验，但是作为在小鼠细胞中也起作用的标签，我们计划使用敲低系统进行研究，使用敲低系统，使用Thalidomide类似物在野生型小鼠中起作用。

项目成果

A degron system targeting endogenous PD-1 inhibits the growth of tumor cells in mice.

• DOI: 10.1093/narcan/zcac019
• 发表时间: 2022-06
• 期刊: NAR cancer
• 影响因子: 5.1

The SMASh degron system targeting endogenous PD-1 inhibits the growth of MC-38 tumor cells in mice.

SMASh degron 系统靶向内源性 PD-1，抑制小鼠体内 MC-38 肿瘤细胞的生长。

• 发表时间: 2022
• 作者: Kamiya Genta;Kitada Nobuo;Saito-Moriya Ryohei;Obata Rika;Iwano Satoshi;Miyawaki Atsushi;Hirano Takashi;Maki Shojiro;岩野 智;岩野 智;堀江恭二;成瀬智恵，杉原一司，パンシュチ，宮崎龍彦，杉山文博，浅野雅秀;成瀬智恵，杉原一司，パンシュチ，宮崎龍彦，杉山文博，浅野雅秀
• 通讯作者: 成瀬智恵，杉原一司，パンシュチ，宮崎龍彦，杉山文博，浅野雅秀

必要な時だけ標的タンパク質を壊すがん治療―薬剤投与によるマウス内在性PD-1の分解―

仅在必要时破坏靶蛋白的癌症治疗 - 通过给药降解小鼠内源性 PD-1 -

内在性PD-1へのデグロンタグ組込みによるマウス生体におけるがん細胞増殖の抑制

通过将降解决定子标签整合到内源性 PD-1 中抑制活体小鼠的癌细胞增殖

• 发表时间: 2022
• 作者: Kamiya Genta;Kitada Nobuo;Saito-Moriya Ryohei;Obata Rika;Iwano Satoshi;Miyawaki Atsushi;Hirano Takashi;Maki Shojiro;岩野 智;岩野 智;堀江恭二;成瀬智恵，杉原一司，パンシュチ，宮崎龍彦，杉山文博，浅野雅秀
• 通讯作者: 成瀬智恵，杉原一司，パンシュチ，宮崎龍彦，杉山文博，浅野雅秀