リボソーム融合型ナノポア技術による１分子タンパク質網羅定量解析

利用核糖体融合纳米孔技术对单分子蛋白质进行全面定量分析

基本信息

批准号：
21K18232
负责人：
上村想太郎
金额：
$ 16.64万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Pioneering)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

当該年度においては、ペプチドの１分子ナノポア計測実現を目指し、平面膜上での脂質膜再構成とSecYEGチャネルタンパク質の挿入、及びSecAタンパク質との複合体に対する基質ペプチドの膜通過シグナルの検出を試みた。4つのチャネルを同時計測可能なナニオンテクノロジーズ社のOrbit miniと温度コントローラーを導入し、温度条件を変えながら脂質膜の構築を試した。脂質膜は多重膜にならず、脂質二重膜の単重膜が形成される条件を決めることができた。さらに、SecYEGが膜に挿入されることを印加電圧を可変にした電流応答の変化で複数回確認できたが、導入効率は低いままであったため、ペプチド通過計測には至らなかった。次年度においては、これらを改善するために、PURE systemを用いた無細胞合成系によるSecYEG挿入や脂質膜の組み合わせの改良、さらには平面膜のみならず、液滴接触法を用いて実験系の改良を試みる。これによってペプチドの通過信号を得ることができたら、複数種類のペプチドの通過データをいくつかの印加電圧で取得し、それらに対して機械学習による解析を行う。その後、複数種類のペプチドを分類することを通過電流データのみで行うことを目標とする。さらには、リボソーム分子とSecYEGとの融合を試み、合成過程と新生ペプチドの通過過程の同時測定を試みる。このために、シグナル配列の検討、温度条件検討、及びイオン強度条件検討が必須となる。

本财年，以实现肽的单分子纳米孔测量为目标，我们尝试在平面膜上重建脂质膜，插入SecYEG通道蛋白，并检测与SecA蛋白复合的底物肽的过膜信号。我们安装了 Nanion Technologies 的 Orbit mini（可以同时测量四个通道）和温度控制器，并尝试在改变温度条件的同时构建脂质膜。我们能够确定脂质膜不形成多层膜而形成单个脂质双层膜的条件。此外，虽然我们能够通过改变施加电压来改变电流响应来多次确认SecYEG被插入膜中，但由于引入效率仍然很低，我们无法测量肽的通过。明年，为了改进这些，我们将使用 PURE 系统和脂质膜组合的无细胞合成系统来改进 SecYEG 的插入，并且不仅使用平膜，还改进实验系统尝试改进液滴接触方法。一旦由此获得肽转运信号，就可以在多个施加电压下获取多种类型肽的转运数据，并使用机器学习进行分析。之后，目标是仅使用传递的当前数据对多种类型的肽进行分类。此外，我们将尝试将核糖体分子与SecYEG融合，并同时测量新生肽的合成过程和通过过程。为此，必须检查信号序列、温度条件和离子强度条件。