キネシン・微小管結合様式の1分子顕微解析

驱动蛋白-微管结合模式的单分子显微分析

基本信息

批准号：
02J03387
负责人：
上村想太郎
金额：
$ 1.92万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞中の物質輸送を担っているキネシンやミオシンVは1分子でレールタンパク質である細胞骨格から解離することなく数μmの距離だけ移動することができる。しかし、その動作機構や動作原理はまだ完全に明らかになっていないのが現状である。そこで我々は1分子力学測定の技術を駆使してこれらを明らかにするのが研究目的である。昨年度までは光ピンセット法を用いてキネシン・微小管結合を破断させることにより、各ヌクレオチド状態での結合様式を特定した(Uemura, S.et al.Proc Natl Acad Sci USA.99,5977-5981.(2002))。また、ADP濃度を変化させることで単頭強結合・弱結合の割合変化を捉えることができ、負荷を加える方向によってADPの結合平衡が変化するという結果を得た(Uemura, S and Ishiwata, S.Nature Struct Biol.10,308-311.(2003))。今年度はキネシンと同様のメカニズムで運動すると考えられている1分子ミオシンVについて研究を行った。東北大学・学際科学センターの樋口秀男教授との協同研究のもとで高速運動測定が可能な斜光暗視野照明を用いた顕微鏡システムを用いてステップ運動を詳細に解析した。その結果、36nm運動ステップが12nm+24nmのサブステップに分解できる中間状態を持つことを明らかにした。中間状態は4msと非常に短いがATPase活性を抑制するBDM(2,3-butanedione monoxime)を加えると7〜8倍長くなった。さらに、Yale大学のEnrique De La Cruzらグループとの協同研究により生化学的なデータを加えることができ、新しいサブステップを考慮したモデルを構築することができた(Uemura, S et al.Nature Struct ＆ Mol Biol.11,877-883.(2004))。

负责在细胞内运输物质的驱动蛋白和肌球蛋白 V 的一个分子可以移动几微米而不与细胞骨架分离，细胞骨架是一种轨道蛋白。但目前其运行机制和原理尚不完全清楚。因此，我们的研究目的是充分利用单分子动力学测量技术来阐明这些问题。直到去年，我们通过使用光镊方法破坏驱动蛋白-微管键来鉴定每个核苷酸状态的结合模式（Uemura, S. et al. Proc Natl Acad Sci USA.99, 5977-5981. (2002)）。此外，通过改变ADP浓度，我们能够检测单头强结合和弱结合比例的变化，并且我们得到了ADP的结合平衡根据施加负载的方向而变化的结果（ Uemura, S 和 Ishiwata, S.Nature Struct Biol.10,308-311.(2003))。今年，我们对肌球蛋白 V 的单分子进行了研究，人们认为它的移动机制与驱动蛋白类似。我们与东北大学跨学科科学中心的 Hideo Higuchi 教授合作，使用可以测量高速运动的倾斜暗场照明的显微镜系统详细分析了步进运动。结果表明，36nm 运动步骤具有可以分解为 12nm+24nm 子步骤的中间状态。中间状态非常短，为 4 ms，但当添加抑制 ATP 酶活性的 BDM（2,3-丁二酮单肟）时，中间状态会延长 7 至 8 倍。此外，通过与耶鲁大学的 Enrique De La Cruz 及其团队的合作研究，我们能够添加生化数据并构建一个考虑新子步骤的模型 (Uemura, S et al.Nature Struct & Mol Biol. 11, 877 -883。（2004））。