Elucidation of the molecular mechanism and pathophysiology of Niemann-Pick disease type C by a multifaceted approach

通过多方面的方法阐明 C 型尼曼-皮克病的分子机制和病理生理学

基本信息

批准号：
21K07814
负责人：
前川正充
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ニーマンピック病C型 (NPC) は、コレステロール輸送タンパク質の機能的欠損を伴う遺伝性疾患であるが、その病態分子機構・病態生理には未だ不明な部分が多い。当研究室ではこれまで、NPC患者血液中で増加するN-palmitoyl-O-phosphocholine-serineなどのバイオマーカーを同定してきたものの、細胞内代謝物の変動の全容は明らかでない。そこで本研究では、NPC病態モデル細胞中を用いたマルチオミクス解析を行った。プロテオミクスにおいては、野生型細胞と、NPC原因遺伝子であるNPC1の一部をノックアウトした2種類のNPCモデル化細胞を用いた。3種の細胞を培養し、洗浄、回収した。タンパク質を抽出し、トリプシン消化した。ペプチドを希釈し、分析した。質量分析計Orbitrap Fusionに液体クロマトグラフEASY-nLC 1000を接続した装置を用い、m/z 375-1600の範囲でData dependent analysisモードで分析した。解析した結果、総計4000を超えるタンパク質の同定に成功した。発現割合が有意に2倍以上に増減したタンパク質がそれぞれ50種前後確認できた。メタボロミクスにおいては、洗浄後回収した細胞を冷メタノール中で超音波処理し、遠心上清を乾燥した後、メタノールで再溶解し、分析した。C18分析カラムを用い、飛行時間型質量分析計に超高速液体クロマトグラフを接続した装置を用いた。試料を注入後、グラジエントモードで、低分子領域をスキャン分析した。測定データを補正後、統計解析した。NPCモデル細胞における発現割合が、統計的に有意に2倍以上増加または0.5倍以下に減少したピークを、それぞれ70種程度確認できた。現在、創薬標的となる代謝経路探索を試みている。

C 型尼曼-匹克病 (NPC) 是一种与胆固醇转运蛋白功能缺陷相关的遗传性疾病，但该疾病的分子机制和病理生理学仍然很大程度上未知。尽管我们的实验室迄今为止已鉴定出鼻咽癌患者血液中增加的生物标志物，例如N-棕榈酰-O-磷酸胆碱-丝氨酸，但细胞内代谢物变化的全部程度尚不清楚。因此，在本研究中，我们利用鼻咽癌病理模型细胞进行多组学分析。对于蛋白质组学，我们使用了两种类型的 NPC 建模细胞：野生型细胞和部分敲除 NPC1（一种导致 NPC 的基因）。培养、洗涤并收集三种类型的细胞。提取蛋白质并用胰蛋白酶消化。稀释并分析肽。使用连接至液相色谱仪 EASY-nLC 1000 的质谱仪 Orbitrap Fusion 在 m/z 375-1600 范围内以数据相关分析模式进行分析。分析结果显示，总共成功鉴定了 4,000 多种蛋白质。确认了大约50种蛋白质，其表达比率显着增加或减少了2倍以上。在代谢组学中，洗涤后收集的细胞在冷甲醇中超声处理，干燥离心上清液，然后用甲醇重新溶解并进行分析。使用C18分析柱，并使用与超高效液相色谱仪连接的飞行时间质谱仪。注入样品后，以梯度模式扫描低分子量区域并进行分析。对测量数据进行校正后，进行统计分析。我们能够识别大约70个峰，其中NPC模型细胞中的表达比率统计上显着增加超过2倍或减少0.5倍或更小。目前，我们正在尝试寻找可以作为药物发现目标的代谢途径。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法を活用したニーマンピック病C型のバイオマーカー分析研究

使用液相色谱/串联质谱法进行 C 型尼曼匹克病生物标志物分析研究

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
前川正充;眞野成康
通讯作者：
眞野成康

Development of a Highly Sensitive and Rapid Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometric Method Using a Basic Mobile Phase Additive to Determine the Characteristics of the Urinary Metabolites for Niemann–Pick Disease Type C

开发一种使用基本流动相添加剂的高灵敏快速液相色谱-串联质谱方法来确定 C 型尼曼-匹克病尿液代谢物的特征

DOI：
10.1248/bpb.b22-00185
发表时间：
2022
期刊：
Biological and Pharmaceutical Bulletin
影响因子：
2
作者：
Maekawa Masamitsu;Miyoshi Keitaro;Narita Aya;Sato Toshihiro;Sato Yu;Kumondai Masaki;Kikuchi Masafumi;Higaki Katsumi;Okuyama Torayuki;Eto Yoshikatsu;Sakamaki Hiroshi;Mano Nariyasu
通讯作者：
Mano Nariyasu

質量分析を活用したニーマンピック病バイオマーカー候補分子の構造決定と性能評価

使用质谱法测定尼曼-皮克病生物标志物候选分子的结构和性能评估