CAR-T細胞機能を向上させるCAR構造の最適化

优化CAR结构，提高CAR-T细胞功能

• 批准号: 22K07298
• 负责人: 西尾 信博
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K07298/
• 关键词: CAR; GD2; piggyBac

本研究では、CARの構成成分のうち、scFv部分の中のVHとVLをつなぐlinker部分の長さとspacer部分の長さに着目して、CARを改変し、その機能解析を実施する。ベースとなるCARはGD2を標的としたGD2.CARを用い、遺伝子導入には代表者らが開発したpiggyBacトランスポゾン法を用いる。linkerとspacerを改変した複数のCARコンストラクトを作成し、細胞殺傷効果と持続性において最適なGD2.CARを作製し、神経芽腫細胞に対するGD2.CAR-T細胞の抗腫瘍効果を評価する。異なる抗原認識部位の配列情報とCD28、4-1BBなどの異なる共刺激分子をもつGD2.CARに、さらにlinkerとspacerを改変した複数のGD2.CARコンストラクトを作成した。上記のGD2.CARを、申請者が所有するCD19.CARトランスポゾンベクター（pIRII-CD19.28.ζ）のCAR配列と入れ替え（pIRII-GD2.28.ζまたはpIRII-GD2.4-1BB.ζ）、GD2.CARトランスポゾンベクターを作成した。末梢血リンパ球に、ヌクレオフェクション装置を用いて、GD2.CARトランスポゾンベクターとpiggyBac遺伝子転位酵素ベクターを導入し、自家feeder細胞とインターロイキン(IL)-7およびIL-15を添加した培地中で共培養し、GD2CAR-T細胞を作成した。フローサイトメトリーを用いてT細胞上のGD2.CAR発現率、CD45RA/CCR7細胞比率等を測定した。さらにCAR-T細胞と神経芽腫細胞株をサイトカイン無添加・10%血清存在下で共培養し、GD2.CAR-T細胞の抗原特異性、細胞傷害活性、細胞表面exhaustionマーカー、CAR-T細胞のpersistencyなどを検討した。

在这项研究中，在汽车的组件中，汽车经过修改，功能分析是通过重点关注连接SCFV部分中VH和VL的连接器部分的长度以及垫片部分的长度。基本车使用gd2.Car靶向GD2，代表使用的Piggybac转座子方法用于基因转移。创建具有改变接头和间隔者的多个汽车构建体，以在细胞杀死和持久性中产生最佳的GD2.Car，并评估GD2.CAR-T细胞对神经母细胞瘤细胞的抗肿瘤作用。还使用gd2.car中的连接器和间隔器改变创建了多个gd2.CAR构建体，该链接具有不同的抗原识别位点的序列信息以及不同的共刺激分子，例如CD28和4-1BB。上述GD2.CAR被申请人拥有的CD19.CAR转座子矢量（PIRII-CD19.28.ζ）的CAR序列取代（PIRII-GD2.28.ζ或PIRII-GD2.4-1BB.MET）和A GD2.CAR Transposon vector。使用核反理装置引入外周血淋巴细胞，以引入GD2.CAR转座子载体和PiggyBac基因转置酶载体，并在补充的培养基中，并在培养基中培养，该培养基含有自体馈物细胞和肠介菌细胞（IL）-7和IL-15，以生成GD2CAR-T2CAR-T2Car-T细胞。流式细胞仪用于测量GD2.Car的表达速率，T细胞上CD45RA/CCR7细胞的比率等。此外，在没有细胞因子添加的10％血清的情况下共培养CAR-T细胞和神经母细胞瘤细胞系，并研究了GD2.CAR-T细胞的抗原特异性，细胞毒性活性，细胞表面衰竭和CAR-T细胞的持久性。