超高分解能分子モニタリングで捉える選択的リグニン分解機構のダイナミクスと包括解析

超高分辨率分子监测捕获木质素选择性降解机制的动力学和综合分析

基本信息

批准号：
11J03215
负责人：
西村裕志
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J03215/
关键词：
核磁気共鳴法木質バイオマス担子菌リグニン生分解機構

项目摘要

本研究は、木質バイオマス資源の有効な利活用に向けて、選択的リグニン分解菌による生分解を高分解能核磁気共鳴法および質量分析法を駆使して捉えることを目的とした。木質は主にセルロース、ヘミセルロース、リグニンから構成される。生分解過程でどのような化学結合が消失し、変化するのかをモニタリングするためには、木質中の各成分の結合相関を2D-NMR上にマッピングする必要がある。特に、選択的リグニン分解菌がどのようにリグニンを分解していくのかを把握するためには、リグニンユニット間の結合情報とリグニンと糖の結合情報が重要である。そこで、できるだけ天然に近い条件で包括的にNMR解析する手法の確立を試みた。溶液NMR法による木質成分の解析は、欧米を中心に数グループから報告されているが、従来法ではユニット間結合の精密構造解析と定量評価を行うための感度、分解能が十分ではなかった。また粉砕時の加熱・酸化による構造変化を避けることも重要である。そこで、温和な条件での微粉砕処理法と溶解法の最適化を行った結果、従来法を凌駕する感度と分解能で2D-NMRスペクトルを得ることに成功した。このように、木質のNMR解析において試料調製法、分析法を検討して他のグループを凌駕する解析法を確立できたことは大きな成果である。また定量評価法についても検討を加え、結合定数の相違による違いを、TOROSY/anti-TOROSY法を用いて算出したJ値から補正し定量性を向上する手法を提案することができた。これは木質の生分解機構の解析のみならず、NMR法によるバイオマスの精密評価・定量系全般に適用可能な成果である。さらに、木材腐朽菌の生分解過程を経時的にNMRで詳細に解析し、腐朽形態の相違をNMR法によって観測することができた。また、生分解の鍵を握る二次代謝物について高分解能質量分析法を用いて新規類縁体を同定し、プロファイリング解析を進めた。

本研究的目的是利用高分辨率核磁共振和质谱技术了解选择性木质素降解细菌的生物降解作用，以有效利用木质生物质资源。木材主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。为了监测生物降解过程中哪些化学键丢失或改变，有必要在二维核磁共振上绘制木材中各成分的键关系。特别是，为了了解选择性木质素降解细菌如何降解木质素，有关木质素单元之间以及木质素与糖之间的键的信息非常重要。因此，我们试图在尽可能接近自然的条件下建立一种全面的核磁共振分析方法。几个小组（主要在欧洲和美国）已经报道了使用溶液核磁共振方法分析木材成分，但传统方法的灵敏度和分辨率不足以进行精确的结构分析和单元之间键的定量评估。避免粉碎过程中由于加热和氧化而导致结构变化也很重要。因此，通过在温和条件下优化粉碎方法和溶解方法，我们成功获得了灵敏度和分辨率均超过常规方法的2D-NMR谱。通过这种方式，我们能够研究木材核磁共振分析的样品制备和分析方法，并建立超越其他团队的分析方法，这是一项伟大的成就。我们还研究了定量评估方法，并能够提出一种通过校正由于结合常数差异而与使用 TOROSY/anti-TOROSY 方法计算的 J 值产生的差异来提高定量性能的方法。该结果不仅适用于木材生物降解机制的分析，而且适用于使用核磁共振方法精确评估和量化生物量的所有系统。此外，我们能够使用核磁共振详细分析木材腐烂真菌随时间的生物降解过程，并使用核磁共振观察腐烂形式的差异。此外，我们使用高分辨率质谱法来鉴定对生物降解至关重要的次生代谢物的新类似物，并进行分析。