Elucidation of circadian oscillation mechanism mediated by clock protein complexes

阐明时钟蛋白复合物介导的昼夜节律振荡机制

基本信息

批准号：
18J21063
负责人：
柚木康弘
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、昨年度までに構築したKaiタンパク質間相互作用解析の技術基盤の下に、不均一なリン酸化状態を模倣したKaiC6量体を対象としてKaiA、KaiBとの相互作用解析に取り組んだ。KaiAとの相互作用に関しては、KaiC6量体を構成する脱リン酸化状態のサブユニットとリン酸化状態にあるサブユニットが独立に振舞っており、脱リン酸化状態のサブユニットのみがKaiAとの結合に与っていることを示した。さらに、KaiBとの相互作用には、KaiC6量体中で少なくとも4つのサブユニットがリン酸化状態にあることが必要であり、KaiC6量体を構成するサブユニット間の協同的な振る舞いが重要であることを示した。一方、溶液散乱とゲルろ過クロマトグラフィー法を応用してKaiA-KaiB-KaiC三者複合体の構造情報を取得した。それに基づいて構築した3次元構造モデルを対象に分子動力学シミュレーションによって構造安定性を評価し、三者複合体の構造モデルを提案した。興味深いことに、本複合体において、KaiBと相互作用しているKaiAのNドメインはCドメインを覆っており、これにより他のKaiC6量体との相互作用が妨げられていることがみてとれる。さらには、KaiAとKaiB存在下において、KaiC6量体は特定のリン酸化状態でサブユニットの交換が亢進することを見出した。以上を総合して、当初の計画以上に研究は進展したものと判断した。本研究を通じて、KaiC6量体のリン酸化という微視的状態の変化が、Kaiタンパク質間の巨視的な相互作用を制御する仕組みの一端を明らかにすることができた。本研究の成果は、分子集団として概日リズムを司る時計タンパク質の相互作用の制御機構の理解に資するものである。

今年，我们基于去年建立的Kai蛋白-蛋白相互作用分析技术平台，针对模拟异质磷酸化状态的KaiC六聚体，进行了KaiA和KaiB的相互作用分析。关于与KaiA的相互作用，构成KaiC六聚体的去磷酸化状态的亚基和磷酸化状态的亚基独立地表现，并且只有去磷酸化状态的亚基能够与KaiA结合。此外，与 KaiB 的相互作用需要 KaiC 六聚体中的至少四个亚基处于磷酸化状态，并且组成 KaiC 六聚体的亚基之间的合作行为很重要。同时，通过溶液散射和凝胶过滤色谱方法获得了KaiA-KaiB-KaiC三元配合物的结构信息。通过分子动力学模拟评估了基于此构建的三维结构模型的结构稳定性，提出了三向复合体的结构模型。有趣的是，在这个复合物中，与 KaiB 相互作用的 KaiA 的 N 结构域覆盖了 C 结构域，从而阻止了与其他 KaiC 六聚体的相互作用。此外，我们发现在 KaiA 和 KaiB 存在的情况下，KaiC 六聚体在特定的磷酸化状态下经历增强的亚基交换。考虑到上述所有因素，确定该研究比原计划取得了进一步的进展。通过这项研究，我们能够揭示KaiC六聚体磷酸化微观状态的变化控制Kai蛋白之间宏观相互作用的部分机制。这项研究的结果将有助于理解作为一个分子群控制昼夜节律的时钟蛋白之间相互作用的控制机制。