卵巣移行シグナルを利用した新規遺伝子改変法

利用卵巢迁移信号的新基因修饰方法

基本信息

批准号：
18J10121
负责人：
村上悠
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度は卵黄タンパク質前駆体ビテロジェニン（Vtg）の部分配列（N末300 aa：以下Vtgシグナル）により、緑色蛍光タンパク質（GFP）および発光タンパク質ルシフェラーゼ（LUC）を含む外来タンパク質を卵内へ効率的に輸送できることを見出した。一方でVtgシグナルでは最終目的とするゲノム編集ツール（Cas9）を含めた融合タンパク質（Cas9: GFP）を卵内へ送達できなかったため、Vtgの全長配列を用いることで輸送効率の向上を図った。具体的にはゲノム編集技術CRISPR/Cas9 systemを駆使し、Vtgの終止コドンの直前にCas9: GFP: polyAをノックインしたメダカを作出した。系統化を完了した後、本ノックインメダカについて蛍光観察を行うと、肝臓で明瞭な緑色蛍光が観察された。加えて、本メダカが産出した全ての卵においても明瞭かつ均一な緑色蛍光を確認できた。Vtgシグナルによって本融合タンパク質の輸送を試みた際は、卵内で緑色蛍光が見られなかったため、本結果は全長配列の利用によって狙い通り輸送効率の改善に成功したことを示す。続いて卵内でのCas9のヌクレアーゼ活性を評価するため、標的遺伝子（slc45a2; 黒色色素の合成に関連）を認識するsgRNAを受精卵内へ顕微注入した。注入卵はHeteroduplex mobility assay（HMA）解析によってslc45a2の変異の有無を確認したが、いずれのサンプルからも変異活性を示す結果は得られなかった。この原因としては、Cas9が卵内へ流入する前後で分解されたこと、あるいは卵内でのCas9の蓄積量が不足していること等が考えられる。Vtgは卵内に取り込まれた後、複数のドメインごとに限定分解されることが既知である。したがって各ドメイン間にCas9: GFP: polyAをノックインすることでこの現状の打開を図っている。

在上一个财政年度，蛋黄蛋白生命天然（VTG）部分线（n -End 300 AA：VTG信号）的部分线有效地有效地使用了包括绿色荧光蛋白（GFP）的门诊蛋白，并有效地使用了含有光的蛋白质荧光素酶（LUC）我发现我可以运输它。另一方面，在VTG信号中，融合蛋白（CAS9：GFP）（包括最终的基因组编辑工具（CAS9））无法传递到卵上，因此使用VTG长阵列提高了运输效率。具体而言，Medaka在CAS9：GFP：Polya中敲击了通过完全使用基因组编辑技术CRISPR/CAS9系统创建的Polya。系统化完成后，当观察到这种敲击-inmedaka的荧光时，在肝脏中观察到透明的绿色荧光。此外，在此Medaka产生的所有卵中都证实了清晰均匀的绿色荧光。当试图用VTG信号运输这种融合蛋白时，由于使用整体序列而成功地提高了运输效率，因为在卵中未看到绿色荧光。随后，为了评估Cas9在卵中的核酶活性，SGRNA识别靶向基因（与黑色颜料的合成有关），将其微型注射到受精卵中。杂质迁移率关联分析证实了注射的卵在SLC45A2中具有突变，但从任何样品中均未获得任何后果。原因是CAS9在流入鸡蛋之前和之后已被拆卸，或者CAS9在鸡蛋中的积累不足。众所周知，将VTG限制在卵中后的多个域。因此，我们将在每个域之间敲击CAS9：GFP：polya，以打破这种情况。