卵巣移行シグナルを利用した新規遺伝子改変法

利用卵巢迁移信号的新基因修饰方法

基本信息

批准号：
18J10121
负责人：
村上悠
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度は卵黄タンパク質前駆体ビテロジェニン（Vtg）の部分配列（N末300 aa：以下Vtgシグナル）により、緑色蛍光タンパク質（GFP）および発光タンパク質ルシフェラーゼ（LUC）を含む外来タンパク質を卵内へ効率的に輸送できることを見出した。一方でVtgシグナルでは最終目的とするゲノム編集ツール（Cas9）を含めた融合タンパク質（Cas9: GFP）を卵内へ送達できなかったため、Vtgの全長配列を用いることで輸送効率の向上を図った。具体的にはゲノム編集技術CRISPR/Cas9 systemを駆使し、Vtgの終止コドンの直前にCas9: GFP: polyAをノックインしたメダカを作出した。系統化を完了した後、本ノックインメダカについて蛍光観察を行うと、肝臓で明瞭な緑色蛍光が観察された。加えて、本メダカが産出した全ての卵においても明瞭かつ均一な緑色蛍光を確認できた。Vtgシグナルによって本融合タンパク質の輸送を試みた際は、卵内で緑色蛍光が見られなかったため、本結果は全長配列の利用によって狙い通り輸送効率の改善に成功したことを示す。続いて卵内でのCas9のヌクレアーゼ活性を評価するため、標的遺伝子（slc45a2; 黒色色素の合成に関連）を認識するsgRNAを受精卵内へ顕微注入した。注入卵はHeteroduplex mobility assay（HMA）解析によってslc45a2の変異の有無を確認したが、いずれのサンプルからも変異活性を示す結果は得られなかった。この原因としては、Cas9が卵内へ流入する前後で分解されたこと、あるいは卵内でのCas9の蓄積量が不足していること等が考えられる。Vtgは卵内に取り込まれた後、複数のドメインごとに限定分解されることが既知である。したがって各ドメイン間にCas9: GFP: polyAをノックインすることでこの現状の打開を図っている。

在上一年，我们发现蛋黄蛋白前体卵黄蛋白（VTG）（N末端300 AA：以下称为VTG信号）的子序列可以有效地将异源蛋白质运输，包括绿色荧光蛋白（GFP）和光蛋白荧光素酶（LUC）。另一方面，VTG信号无法传递融合蛋白（CAS9：GFP），包括最终的目标基因组编辑工具（CAS9）进入卵，因此使用VTG的全长序列，我们提高了运输效率。具体来说，我们使用基因组编辑技术CRISPR/CAS9系统来创建一种在VTG终止密码子之前敲击Cas9：GFP：Polya的MEDAKA。系统化完成后，对这种敲击的MEDAKA的荧光观察显示，肝脏中透明绿色荧光。此外，在该Medaka产生的所有卵中还观察到了透明且均匀的绿色荧光。当尝试使用VTG信号运输融合蛋白时，在鸡蛋中未观察到绿色荧光，结果表明，全长序列的使用成功地提高了按预期的运输效率。随后，为了评估鸡蛋中cas9的核酸酶活性，识别靶基因（SLC45A2；与黑色颜料的合成有关）的SGRNA被微注射到受精卵中。通过杂化迁移率分析（HMA）分析，确认注射的卵在SLC45A2中存在突变，但没有结果表明，从任何一个样品中获得了突变活性。这可能是由于Cas9在流入鸡蛋之前和之后分解的事实，或者在鸡蛋中缺乏Cas9积累。众所周知，VTG在鸡蛋中占据后，每个域被限制降解。因此，我们试图通过在每个域之间敲击CAS9：GFP：polya来克服这种当前情况。