ゲノム編集ＥＳ細胞を用いた１世代個体解析法の開発と性染色体機能解析への応用

利用基因组编辑ES细胞开发一代个体分析方法及其在性染色体功能分析中的应用

• 批准号: 17J09669
• 负责人: 松村 貴史
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-04-26 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J09669/
• 关键词: 男性不妊; ゲノム編集; CRISPR/Cas9; ES細胞; 遺伝子改変マウス; 有性生殖細胞

本研究においては、CRISPR/Cas9システムを用いて、精子形成における遺伝子の機能を迅速に解析するシステムを開発し、性染色体遺伝子もしくはゲノム領域の機能を解析した。具体的には、緑色蛍光を発するES細胞にCRISPR/Cas9システムを用いて目的変異を導入し、キメラマウス精巣で変異生殖細胞の精子形成を緑色蛍光により観察した。X染色体では、KOマウスが胎生致死となる1遺伝子を含む6遺伝子について、前年度にESキメラマウスの精子形成に異常がないことを確認した。本年度は、胎生致死を示す1遺伝子を除く5遺伝子について、ESキメラマウスから変異アレルが伝わった次世代のKOマウスで、精子形成を再度観察し、これら遺伝子が精子形成には必須ではないことを明らかにした。これらの成果は現在学術雑誌に投稿中である。また、Y染色体については、男性不妊の原因と考えられている領域について、領域内遺伝子のKOマウスの作製と解析に加え、領域のほぼ全長を欠損したY染色体を持つESキメラマウスの解析を行い、この領域がマウスにおいては正常な精子形成に必須ではないことを明らかにした。本研究で確立した1世代個体解析法は個体レベルでの表現型解析に費やす時間を短縮し、致死性遺伝子の機能を解析できる。また、この手法を用いて得られた知見は男性不妊のメカニズム解明に有用である。以上の結果はまとめて国内の学会で発表し、Ｙ染色体遺伝子の解析結果をまとめ筆頭著者として学術雑誌に発表した。また不妊因子領域の欠損マウスの解析結果については現在学術雑誌に投稿準備中である。

在本研究中，我们利用CRISPR/Cas9系统开发了一种快速分析精子发生过程中基因功能的系统，对性染色体基因或基因组区域的功能进行分析。具体来说，我们使用CRISPR/Cas9系统将所需的突变引入发出绿色荧光的ES细胞中，并利用绿色荧光观察嵌合小鼠睾丸中突变生殖细胞的精子发生。在X染色体上，我们在前一年证实了ES嵌合体小鼠的精子发生过程中的6个基因没有出现异常，其中包括一个导致KO小鼠胚胎致死的基因。今年，我们将重新观察下一代 KO 小鼠的精子发生，这些小鼠继承了 ES 嵌合体小鼠的 5 个基因的突变等位基因，排除了导致胚胎致死的一个基因，并证明这些基因对于精子发生来说并不是必需的。 。这些结果目前正在提交给学术期刊。关于Y染色体，除了创建并分析被认为是导致男性不育的区域基因的KO小鼠外，我们还分析了Y染色体几乎整个区域被删除的ES嵌合体小鼠。研究表明该区域对于小鼠正常的精子发生并不是必需的。本研究建立的一代个体分析方法可以缩短个体水平表型分析的时间并分析致死基因的功能。此外，使用这种方法获得的结果对于阐明男性不育的机制很有用。上述结果在国内学术会议上进行总结并发表，Y染色体基因分析结果以第一作者的身份在学术期刊上总结发表。此外，我们目前正准备将缺乏不孕因子区域的小鼠的分析结果提交给学术期刊。