ゲノム編集ＥＳ細胞を用いた１世代個体解析法の開発と性染色体機能解析への応用

利用基因组编辑ES细胞开发一代个体分析方法及其在性染色体功能分析中的应用

• 批准号: 17J09669
• 负责人: 松村 貴史
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-04-26 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J09669/
• 关键词: 男性不妊; ゲノム編集; CRISPR/Cas9; ES細胞; 遺伝子改変マウス; 有性生殖細胞

本研究においては、CRISPR/Cas9システムを用いて、精子形成における遺伝子の機能を迅速に解析するシステムを開発し、性染色体遺伝子もしくはゲノム領域の機能を解析した。具体的には、緑色蛍光を発するES細胞にCRISPR/Cas9システムを用いて目的変異を導入し、キメラマウス精巣で変異生殖細胞の精子形成を緑色蛍光により観察した。X染色体では、KOマウスが胎生致死となる1遺伝子を含む6遺伝子について、前年度にESキメラマウスの精子形成に異常がないことを確認した。本年度は、胎生致死を示す1遺伝子を除く5遺伝子について、ESキメラマウスから変異アレルが伝わった次世代のKOマウスで、精子形成を再度観察し、これら遺伝子が精子形成には必須ではないことを明らかにした。これらの成果は現在学術雑誌に投稿中である。また、Y染色体については、男性不妊の原因と考えられている領域について、領域内遺伝子のKOマウスの作製と解析に加え、領域のほぼ全長を欠損したY染色体を持つESキメラマウスの解析を行い、この領域がマウスにおいては正常な精子形成に必須ではないことを明らかにした。本研究で確立した1世代個体解析法は個体レベルでの表現型解析に費やす時間を短縮し、致死性遺伝子の機能を解析できる。また、この手法を用いて得られた知見は男性不妊のメカニズム解明に有用である。以上の結果はまとめて国内の学会で発表し、Ｙ染色体遺伝子の解析結果をまとめ筆頭著者として学術雑誌に発表した。また不妊因子領域の欠損マウスの解析結果については現在学術雑誌に投稿準備中である。

在这项研究中，开发了一种系统来快速分析使用CRISPR/CAS9系统在精子发生中的基因功能，并分析了性染色体基因或基因组区域的功能。具体而言，将靶突变引入ES细胞中，使用CRISPR/CAS9系统发射绿色荧光，并通过绿色荧光观察到嵌合小鼠睾丸中突变生殖细胞的精子发生。在X染色体上，我们证实了上一年ES嵌合小鼠的精子发生异常，其中六个基因，其中一个基因，该基因会导致KO小鼠在胚胎生命中死亡。今年，我们在下一代KO小鼠中再次观察到了精子发生，在该小鼠中，突变等位基因从ES嵌合小鼠转移了五个基因，除了一种表现出胎儿致死性的基因，并揭示了这些基因对于精子生成并不是必不可少的。这些结果目前已提交给学术期刊。关于Y染色体，除了用区域内基因的KO小鼠的创建和分析外，我们还对ES嵌合小鼠进行了分析，其Y染色体缺乏该区域的整个长度，这表明该区域对于小鼠的正常精子发生并不是必不可少的。本研究中建立的一代单个分析方法减少了在个体水平上表型分析的时间，并可以分析致命基因的功能。此外，使用此技术获得的发现对于阐明男性不育症的机制有用。上述结果是在日本学术会议上提出的，Y染色体基因分析的结果被编译并在一本学术期刊中作为主要作者。此外，目前正在准备提交学术期刊的小鼠缺失小鼠区域的分析结果。