ゲノム編集技術を基盤とした次世代型トランスジェニック動物作製技術の開発

基于基因组编辑技术的下一代转基因动物生产技术开发

基本信息

批准号：
17J02822
负责人：
重田美津紀
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J02822/
关键词：
ゲノム編集ツメガエルセーフハーバー

项目摘要

遺伝子機能の解析法として外来遺伝子の挿入は有効な手段である。両生類においては、メガヌクレアーゼISce-Iや精子核移植法によるトランスジェネシスが主流である。しかしながら、この方法は挿入されるコピー数やゲノム上の位置を指定できない。加えて、位置効果により外来遺伝子がF1以降にサイレンシングを受けるとの報告が多数ある。ヒトのAAVS locusやマウスのRosa26への外来遺伝子導入に相当する、「Safe harbor system」が逆遺伝学的ストラテジーを用いた今後の両生類研究において必要不可欠であるが、未だ確立されていない。そこで、外来遺伝子を安定的に発現する個体レベルでのシステムを確立するため、ネッタイツメガエルのセーフハーバー領域へのリコンビナーゼの認識配列の挿入をCRISPR-Cas9を用いて試みた。すでに研究室では、CRISPR-Cas9を用いた標的遺伝子へのレポーター遺伝子の挿入システムを確立しており、この方法を用いてセーフハーバー領域へのレポーター遺伝子のノックインを実施した。ノックインが成功すれば目にRFPが発現するはずであったが、明確な蛍光を観察することはできなかった。一方、実験個体においてゲノム配列を確認したところ、予定されている配列が検出されたため、ノックイン自体は成功していることが確認できた。これらの結果から、セーフハーバーと考えられた候補の部位においてもノックインされたレポーター遺伝子の構造によって、発現が抑制されている可能性と、挿入される際にレポーター遺伝子等に予期せぬ変異が導入されている可能性が考えられた。

插入外源基因是分析基因功能的有效方法。在两栖动物中，使用巨核酸酶ISCE-I和精子转移方法的转基因是主流。但是，该方法无法指定要插入的副本数量或基因组上的位置。此外，还有许多报道称，由于位置影响，外国基因在F1后经历了沉默。 “安全港系统”与将外国基因引入人AAVS和小鼠Rosa26相对应，对于使用反向遗传策略的未来两栖动物研究至关重要，但尚未确定。因此，为了在稳定表达外国基因的个体水平上建立一个系统，我们试图使用CRISPR-CAS9将重组酶的识别顺序插入到蛙属的安全港地区。该实验室已经建立了一种使用CRISPR-CAS9将报告基因插入靶基因的系统，并使用此方法进行了记者基因的敲入，将记者基因的敲入进入安全港区域。成功的敲入应该导致眼睛中的RFP表达，但无法观察到明显的荧光。另一方面，当在实验个体中确认基因组序列时，检测到了计划的序列，并确认敲入本身是成功的。这些结果表明，在候选位点上敲击的报告基因的结构可能会抑制表达，该基因被认为是安全港，并且在插入后的记者基因等中可能引入意外突变。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Developmental changes in drug-metabolizing enzyme expression during metamorphosis of <i>Xenopus tropicalis </i>

热带爪蟾变态过程中药物代谢酶表达的发育变化

DOI：
10.2131/jts.42.605
发表时间：
2017
期刊：
The Journal of Toxicological Sciences
影响因子：
0
作者：
Mori J.;Sanoh S.;Kashiwagi K.;Hanada H.;Shigeta M.;Suzuki K.;Yamamoto T.;Kotake Y.;Sugihara K.;Kitamura S.;Kashiwagi A.;Ohta S.
通讯作者：
Ohta S.

ネッタイツメガエルの変態におけるatg5とatg7の関与

atg5和atg7参与埃及伊蚊的变态