Gli転写因子による多様なシグナル伝達の制御機構の解明

阐明Gli转录因子多种信号转导的控制机制

基本信息

批准号：
21770254
负责人：
LEHMANN Ingo T.
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Okinawa Institute of Science and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2009
资助国家：
日本
起止时间：
2009 至 2010
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21770254/
关键词：
ヘッジホッグ Gli タンパク質複合体

项目摘要

1. シグナル伝達因子ヘッジホッグ経路において中心的役割を担う転写因子Gli1-3複合体の構成因子の同定1-1. GIi1-3を誘導的に発現する細胞株確立のため、それぞれのDNAコンストラクトを作製した。Gli1(野生型);Gli1cDNAをpcDNA3を基にしたSF-TAPベクターに導入した。Gli2(野生型);Gli1と同様にGli2cDNAをSF-TAPベクターに導入した。塩基配列を確認したところデータベース上の配列と異なり、2カ所のアミノ酸を置換する変異を確認したので、これを部位特異的ミュータジェネシスによりデータベース上の配列に変換して野生型として用いた。Gli3(野生型);Gli1と同様にGli3cDNAをSF-TAPベクターに導入した。それぞれのコンストラクトについては、塩基配列を確認している。各cDNAについては他研究室から寄与されたものを用いた。1-2. Gli1-3を誘導的に発現する細胞株の確立MEF/3T3Tet-off細胞株(Clontech);数回試みた結果、この細胞を用いてGli1-3を構成的に発現する細胞株確立はこれまでのところ失敗に終わっている。NIH3T3Tet-on細胞株(Clontech);現在細胞株の選択過程にあるが、ほぼ細胞株は確立されつつある。2. 質量分析によるGli複合因子同定法の確立GliホモログであるCiを誘導的に発現するハエ培養細胞を用いて、その複合体を単離し、構成因子を質量分析機により同定する方法を確立した。既知の構成因子であるFu,Costa12,Sufuを含む48個の因子を独立した3回の実験のうち2回の実験で同定した。3. 質量分析によるタンパク質ユビキチン化残基同定法の最適条件の検討Ciのユビキチン化残基による制御が転写抑制型Ci(プロテオソームによる部分分解により形成される)の形成に重要であるので(Wang & Price. Mol Cell Bio1.2008,28(18):5555-68)、質量分析機によるポリユビキチン化残基の同定法をGliに応用すべくその条件検討を行った。これまでの結果により特定の残基を同定できたことから、Gliに適用できる条件であると推定している。

1. 鉴定在信号转导因子 Hedgehog 通路中起核心作用的转录因子 Gli1-3 复合物的成分 1-1 为了建立诱导表达 Gli1-3 的细胞系，创建了每种 DNA 构建体。 Gli1（野生型）；Gli1 cDNA 被引入基于 pcDNA3 的 SF-TAP 载体。 Gli2(野生型)；以与Gli1相同的方式将Gli2 cDNA导入SF-TAP载体。当确认核苷酸序列时，发现它与数据库中的序列不同，并且存在两个位置氨基酸替换的突变，因此通过定点诱变将其转换为数据库中的序列，并用作野生型。 Gli3(野生型)；以与Gli1相同的方式将Gli3 cDNA导入SF-TAP载体。每个构建体的核苷酸序列已得到确认。每个 cDNA 均由另一个实验室提供。 1-2.诱导表达Gli1-3的细胞系MEF/3T3Tet-off细胞系的建立（Clontech）；经过多次尝试，我们发现组成型表达Gli1-3的细胞系的建立至今尚未成功。 NIH3T3Tet-on细胞系（Clontech）：我们目前正在选择细胞系，但细胞系已基本建立。 2.建立使用质谱鉴定Gli复合物因子的方法使用诱导表达Gli同源物Ci的培养果蝇细胞，我们建立了使用质谱仪分离复合物并鉴定其组成因子的方法。三个独立实验中的两个确定了 48 个因子，包括已知的组成因子 Fu、Costa12 和 Sufu。 3. 通过质谱鉴定蛋白质泛素化残基方法的最佳条件的检查由于泛素化残基对 Ci 的调节对于转录抑制子类型 Ci（由蛋白酶体部分降解形成）的形成很重要（Wang & Price. Mol Cell） Bio1.2008, 28(18):5555-68)，我们研究了将质谱仪鉴定多泛素化残基的方法应用于Gli的条件。由于我们能够根据迄今为止的结果识别特定残基，因此我们估计这些条件适用于 Gli。