生命を維持するＤＮＡ複製装置はどのように形成されてきたか～アーキア研究から迫る～

维持生命的DNA复制机器是如何形成的？～从古菌研究走近～

基本信息

批准号：
16J02633
负责人：
永田麻梨子
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-04-22 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

H30年度は超好熱性アーキアThermococcus kodakarensisにおけるDNA複製進行機構についての解析を進めた。これまでの解析では、複製ヘリカーゼMCMはGINSによって活性促進が見られるものの、GAN/Cdc45はヘリカーゼ活性に影響を与えなかった。また、GINSはMCM、GANだけでなく、複製ポリメラーゼ(PolDと推定される)との結合が見られている一方で、PolDとMCM、GANとの結合は検出できていない。PolD存在下でのGAN-MCM-GINS複合体 (GMG)のヘリカーゼとしての機能を調べたところ、PolDとMCMがGINSを介して相互作用することで、MCMのATPase/ヘリカーゼ活性が促進されることを発見した。これは、GMGとPolDが機能的なレプリソーム構成因子であることを示している。T. kodakarensisのgan遺伝子欠損株は高温致死を示すことを以前報告したが (Nagata et al. 2017)、リコンビナントタンパク質を用いたin vitroにおけるヘリカーゼと融合させた高温DNA合成反応もまた、GMG-PolDにおいて機能し、T. kodakarensisの生育温度範囲である60-90°Cにおいて再現ができたことから、in vitro高温DNA複製系の確立にとってGANは重要な役目を果たすと考えられる（Nagata et al. in preparation）。また、DNA複製進行中に露出した一本鎖DNAを保護すると考えられるReplication protein A(RPA)とレプリソーム構成因子の相互作用を調べたところ、PolDとの特異的な相互作用およびPolDのDNA合成活性の促進が見られた。この促進は、RPAが鋳型DNAの二次構造をほどくことで、PolDのDNA合成活性を補助する働きにも由来すると考えられる（Nagata et al. 2019）。

2019财年，我们对超嗜热古菌Thermococcus kodakarensis的DNA复制进程机制进行了分析。先前的分析表明，GINS 促进复制解旋酶 MCM 的活性，但 GAN/Cdc45 对解旋酶活性没有影响。此外，虽然已观察到 GINS 不仅与 MCM 和 GAN 结合，而且还与复制聚合酶（推测为 PolD）结合，但尚未检测到 PolD 与 MCM 和 GAN 之间的结合。我们研究了 GAN-MCM-GINS 复合物 (GMG) 在 PolD 存在下作为解旋酶的功能，发现 PolD 和 MCM 之间通过 GINS 的相互作用促进了 MCM 的 ATP 酶/解旋酶活性。这表明 GMG 和 PolD 是功能性复制体组件。我们之前报道了 T. kodakarensis gan 基因缺陷菌株表现出高温致死性（Nagata et al. 2017），但体外使用与解旋酶融合的重组蛋白进行的高温 DNA 合成反应也表明，GMG-PolD 是可以在 60-90°C 的 T. kodakarensis 生长温度范围内重现这一点。 GAN被认为在建立体外高温DNA复制系统方面发挥着重要作用（Nagata等人正在准备中）。此外，我们研究了复制蛋白A（RPA）和复制体构成因子之间的相互作用，RPA被认为可以保护DNA复制过程中暴露的单链DNA，并发现与PolD和DNA合成活性之间存在特异性相互作用。 PolD 被认为得到了晋升。这种提升被认为是由于 RPA 通过解开模板 DNA 的二级结构来协助 PolD 的 DNA 合成活性的作用 (Nagata et al. 2019)。

项目成果

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专利数量（0）

Atomic structure of an archaeal GAN suggests its dual roles as an exonuclease in DNA repair and a CMG component in DNA replication.

DOI：
10.1093/nar/gkw789
发表时间：
2016-11-02
期刊：
Nucleic acids research
影响因子：
14.9
作者：
Oyama T;Ishino S;Shirai T;Yamagami T;Nagata M;Ogino H;Kusunoki M;Ishino Y
通讯作者：
Ishino Y

Euryarchaea-specific RecJ-like protein may work in stalled fork repair with Hef.

广古菌特异性 RecJ 样蛋白可能在 Hef 修复停滞叉中发挥作用。

DOI：
发表时间：
2018
期刊：
影响因子：
0
作者：
Mariko Nagata;Sonoko Ishino;Takeshi Yamagami;Jan-Robert Simons,Tamotsu Kanai;Haruyuki Atomi;and Yoshizumi Ishino.
通讯作者：
and Yoshizumi Ishino.

超好熱性アーキアThermococcus kodakarensisの複製ヘリカーゼ複合体に関する研究～GAN (Cdc45/RecJ) -GINSの相互作用を中心にして～

超嗜热古菌Thermococcus kodakarensis复制解旋酶复合物的研究~聚焦GAN (Cdc45/RecJ)-GINS相互作用~