魚類グランザイムによる細胞傷害機構解明とそれに基づく水産用ワクチン評価法の開発

阐明鱼类颗粒酶引起的细胞毒性机制并开发基于该机制的海洋疫苗评价方法

• 批准号: 16J01101
• 负责人: 松浦 雄太
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Fisheries Research and Education Agency (2017)Nihon University (2016)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-22 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J01101/
• 关键词: セリンプロテアーゼ; 細胞傷害; 貪食細胞; 細胞性免疫; ギンブナ; グランザイム; ワクチン検定法; 酵素; 細胞傷害機構

本研究では、昨年度の研究成果により見出した細胞傷害に関わるグランザイム様酵素のさらなる機能解析を行った。本酵素の組織分布を調べるため、本酵素に対するモノクローナル抗体を作製し、凍結組織切片を用いた蛍光免疫染色を行なった。その結果、腎臓にて造血された貪食細胞が本酵素の産生源となり、鰓や皮膚など外界に接する組織に移動していることが示唆された。次に、本酵素の発現制御機構を調べるため、トール様受容体（TLR）リガンドによる刺激実験を行い、本酵素の発現を制御するTLR経路を調べた。その結果、TLR2,3,4それぞれに対するリガンドによりその発現が増強されることが判明した。よって、本酵素は外界から侵入した抗原や病原体に対する免疫応答に関わっていることが推測され、ワクチンによる免疫賦活効果を確認する指標として利用可能と考えられた。次に、国内養殖業における重要魚種において本酵素を指標とした水産用ワクチン評価法を開発するため、これら魚種における本酵素のホモログ遺伝子探索を試みた。しかし、ブリ、カンパチ、マダイ、ヒラメのESTデータベースを用いた相同性検索並びに系統樹解析の結果、これら魚種においてホモログ遺伝子は存在しなかった。また、酵素活性測定実験を行った結果、本酵素活性はコイ科魚類以外の魚種では検出されなかった。よって、本酵素はコイ科魚類に特有の酵素であることが示唆され、コイ科魚類以外の魚種では本酵素活性を指標とした細胞性免疫機能測定法の実施が困難であることが判明した。今後はコイ科魚類以外の魚種にも存在する細胞傷害関連分子を探索し、それを指標とした手法の検討が必要である。本研究により見出したコイ科魚類特有の酵素はこれまで未報告であり学術的に興味深い。今後、本酵素による免疫機構（細胞傷害機構）が解明されれば、進化の過程でコイ科魚類が独自に産み出した生体防御機構を解き明かすことにつながる。

在这项研究中，我们对去年的研究结果发现的参与细胞损伤的粒酶样酶进行了进一步的功能分析。为了研究该酶的组织分布，我们制备了针对该酶的单克隆抗体，并使用冷冻组织切片进行荧光免疫染色。结果表明，肾脏中的造血细胞吞噬细胞是这种酶的产生来源，并迁移到与外界接触的组织，例如鳃和皮肤。接下来，为了研究该酶的表达控制机制，我们用Toll样受体（TLR）配体进行刺激实验，并研究了控制该酶表达的TLR通路。结果发现，TLR2、3和4的表达被各配体增强。因此，推测这种酶参与了对外界入侵的抗原和病原体的免疫反应，并认为这种酶可以作为确认疫苗免疫刺激效果的指标。接下来，为了开发一种使用该酶作为国内水产养殖业重要鱼类指标的海洋疫苗评价方法，我们尝试在这些鱼类中寻找该酶的同源基因。然而，利用EST数据库对黄尾鱼、鰤鱼、红鲷鱼和比目鱼进行同源搜索和系统发育树分析，这些鱼类中不存在同源基因。另外，酶活性测定实验的结果是，在鲤科以外的鱼类中未检测到该酶活性。因此，该酶被认为是鲤科鱼类特有的酶，并且已经发现在鲤科鱼类以外的鱼类中很难使用该酶活性作为指标来进行细胞介导的免疫功能测量。未来，有必要寻找鲤鱼以外的鱼类中存在的细胞毒性相关分子，并考虑使用它们作为指标的方法。通过这项研究发现的鲤科鱼类特有的酶迄今为止尚未见报道，具有学术意义。未来，如果阐明这种酶引起的免疫机制（细胞损伤机制），将有助于阐明鲤科鱼类在进化过程中独特形成的生物防御机制。

项目成果

魚類の鰭膜を利用した、好中球の機能をin vivoにて測定する新規手法の開発

开发一种利用鱼鳍膜测量体内中性粒细胞功能的新方法

• 发表时间: 2017
• 作者: 松浦雄太;松山知正;藪健史;宮澤龍一郎;司馬肇;中西照幸;松浦雄太 高崎美帆 中西照幸;高岡尚起 松浦雄太 宮澤龍一郎 中西照幸
• 通讯作者: 高岡尚起 松浦雄太 宮澤龍一郎 中西照幸

A simple and non-invasive method for analyzing local immune responses in vivo using fish fin.

一种使用鱼翅分析体内局部免疫反应的简单且非侵入性的方法。

• DOI: 10.1016/j.dci.2017.04.016
• 发表时间: 2017
• 期刊: Dev. Comp. Immunol.
• 作者: Matsuura Y;N. Takaoka;R. Miyazawa;T. Nakanishi
• 通讯作者: T. Nakanishi

魚類白血球の細胞傷害機構に関与するセリンプロテアーゼの同定

鱼类白细胞细胞毒性机制中丝氨酸蛋白酶的鉴定

• 发表时间: 2017
• 作者: 松浦雄太;藪健史;宮澤龍一郎;司馬肇;中西照幸
• 通讯作者: 中西照幸

Effects of IFNγ administration on allograft rejection in ginbuna crucian carp

IFNγ给药对银鲫同种异体移植排斥反应的影响

• 发表时间: 2016
• 作者: Shibasaki;Y.;Hatanaka;C.;Matsuura;Y.;Miyazawa;R.;Yabu;T. and Nakanishi;T.
• 通讯作者: T.

ギンブナ腎臓におけるCD3εの特有な発現機構の解明

阐明肾脏中CD3ε的独特表达机制

• 发表时间: 2017
• 作者: 松浦雄太;松山知正;藪健史;宮澤龍一郎;司馬肇;中西照幸;松浦雄太 高崎美帆 中西照幸;高岡尚起 松浦雄太 宮澤龍一郎 中西照幸;宮澤龍一郎 Navaneethaiyer Umasuthan 松浦雄太 中西照幸;宮澤龍一郎 村田 憲史 黒瀬めぐみ 松浦雄太 中西 照幸
• 通讯作者: 宮澤龍一郎 村田 憲史 黒瀬めぐみ 松浦雄太 中西 照幸