魚類特有の器官「ヒレ」を活用した細胞内寄生細菌に対する細胞性免疫機構の解明

利用鱼类特有的器官鳍阐明针对细胞内寄生细菌的细胞免疫机制

基本信息

批准号：
18H06022
负责人：
松浦雄太
金额：
$ 1.91万
依托单位：
Fisheries Research and Education Agency
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-08-24 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、ブリ類において細胞性免疫を担う細胞を識別するための抗体を作製した。はじめに、ブリ白血球由来cDNAより細胞性免疫を担う細胞であるヘルパーT細胞およびキラーT細胞にそれぞれ特異的に発現するCD4およびCD8分子に対する遺伝子を単離した結果、CD4分子のホモログとしてCD4-1およびCD4-2、CD8分子のアイソフォームとしてCD8αおよびCD8βの計4遺伝子の単離に成功した。なお、本研究で単離した遺伝子は、これまでブリにおいて未報告の分子であった。次に、抗体作製に使用する免疫原を作製するため、CD4およびCD8分子を安定的に発現する細胞の作製を行った。単離した遺伝子をマウス由来細胞にそれぞれ一過的に強制発現させた結果、全ての遺伝子が膜タンパク質として翻訳されることを確認した。強制発現させた細胞は継代培養し、安定発現株の作製に用いた。このうち、安定細胞株の樹立に成功したのはCD4-1、CD4-2、CD8βの3分子であった。作製した安定細胞のうちCD4-1もしくはCD8β発現細胞をマウスに免疫し、定法に従い各分子に対するモノクローナル抗体の作製を行った。ブリ末梢血白血球を用いて抗体を産生するハイブリドーマの単クローン化を行った結果、生きたブリ白血球を認識する抗体の作製に成功した。現在、作製した抗体がCD4-1もしくはCD8βを正確に認識するかについて確認を行っている。

在这项研究中，我们生成了抗体来识别黄尾鱼中负责细胞介导免疫的细胞。首先，我们从Buri白细胞衍生的cDNA中分离出在辅助性T细胞和杀伤性T细胞（负责细胞免疫的细胞）中特异性表达的CD4和CD8分子的基因，并发现CD4-1和CD8是同源物我们成功分离了总共四个基因，CD4-2、CD8α和CD8β，它们是CD8分子的同种型。本研究中分离出的基因是黄尾鱼中以前未报道的分子。接下来，为了创建用于抗体生产的免疫原，我们创建了稳定表达 CD4 和 CD8 分子的细胞。通过在小鼠来源的细胞中瞬时强制表达每个分离的基因，证实所有基因都被翻译为膜蛋白。将强制表达细胞传代培养并用于创建稳定表达菌株。其中，成功建立了三种分子的稳定细胞系：CD4-1、CD4-2和CD8β。用产生的稳定细胞中表达CD4-1或CD8β的细胞对小鼠进行免疫，并根据标准方法产生针对每种分子的单克隆抗体。通过单克隆使用Buri外周血白细胞产生抗体的杂交瘤，我们成功地产生了识别活体Buri白细胞的抗体。我们目前正在确认生产的抗体是否能准确识别 CD4-1 或 CD8β。