熱ショック転写因子σ３２の膜への輸送を介した新奇な機能制御機構

热休克转录因子σ32通过膜运输的新型功能控制机制

• 批准号: 15J05262
• 负责人: 宮﨑 亮次
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J05262/
• 关键词: 熱ショック転写因子σ32; 部位特異的in vivo光架橋法; シグナル認識粒子; 部位特異的in vivo光架橋実験

熱ショック転写因子σ32制御には、SRPや分子シャペロンDnaK/DnaJ等の複数の因子が関与するが、それら因子がどのように関連を持って働くのかは不明である。それを明らかにするために、σ32制御過程の「中間体」を蓄積すると考えられるσ32制御に関わる因子の変異株で、in vivo光架橋解析を行うことによって、σ32とその制御因子の相互作用がどのように変化するかを解析した。そして、σ32制御に関わるSRP受容体FtsYの変異等によって、σ32とSRPタンパク質Ffhの相互作用がわずかに変化することを見出した。しかし、これらの因子の直接的な影響か、細胞とって重要な因子が不全となることによる間接的な影響かを判断することは困難であった。そこで、σ32の合成から分解に至るまでの各細胞因子との相互作用を経時的に観察するために、部位特異的in vivo光架橋法を応用した細胞内でのタンパク質間相互作用のダイナミクスを解析可能な実験系の開発を行った。まず、架橋形成に必要なUV照射時間を従来の数分から1秒程度に、大幅に短縮できる条件を見出した。そして、光架橋実験とパルス・チェイス実験を組み合わせることで、タンパク質の合成からタンパク質複合体を形成する成熟過程を解析できるかを調べた。その実証のために、成熟過程が良く研究された３種の異なるタンパク質をモデル基質として用い、構築した実験系の妥当性・応用性を検証した。その結果、この手法では親水性タンパク質だけでなく膜タンパク質でも解析ができ、また、タンパク質の生合成中間体の折りたたみ状態やタンパク質間相互作用を解析できることを実証した。この手法を用いて、σ32の合成後の挙動を予備的に解析したところ、RNAポリメラーゼと相互作用後、その相互作用は低下し、徐々に分子シャペロン等の制御因子との操作用をするとともに、量が減少していく様子を観察できた。

SRP和分子伴侣DnaK/DnaJ等多种因素参与热休克转录因子σ32的调节，但目前尚不清楚这些因素如何协同作用。为了澄清这一点，我们对参与 σ32 调节的突变株进行了体内光交联分析，这些因子被认为在 σ32 调节过程中积累了“中间体”，我们分析了它是如何变化的。他们还发现，由于参与σ32调节的SRP受体FtsY的突变，σ32和SRP蛋白Ffh之间的相互作用略有变化。然而，一直很难确定这是这些因素的直接作用，还是由于细胞重要因素失效而产生的间接作用。因此，为了观察 σ32 与各种细胞因子从合成到降解随时间的相互作用，我们使用位点特异性体内光交联分析了细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的动态，我们开发了一个可能的实验系统。首先，我们发现了可以显着缩短形成交联所需的紫外线照射时间的条件，从传统的几分钟缩短到约一秒。通过结合光交联实验和脉冲追踪实验，我们研究了是否可以分析从蛋白质合成到蛋白质复合物形成的成熟过程。为了证明这一点，使用成熟过程已得到充分研究的三种不同蛋白质作为模型底物，以验证所构建的实验系统的有效性和适用性。结果，我们证明该方法不仅可以分析亲水蛋白，还可以分析膜蛋白，以及蛋白质生物合成中间体的折叠状态和蛋白质-蛋白质相互作用。利用这种方法，我们初步分析了σ32合成后的行为，发现它与RNA聚合酶相互作用后，相互作用减弱，逐渐可以用分子伴侣等调控因子进行操纵，我能够观察到它是如何变化的。金额减少。

项目成果

A Novel SRP Recognition Sequence in the Homeostatic Control Region of Heat Shock Transcritional Factor σ32

热休克转录因子 σ32 稳态控制区的新型 SRP 识别序列

• 发表时间: 2016
• 作者: T. Hasunuma;T. Kaneko;S. Miyakoshi and Y. Ohta;宮﨑亮次
• 通讯作者: 宮﨑亮次

熱ショック転写因子σ32とシグナル認識粒子の相互作用機構の解析

热激转录因子σ32与信号识别粒子相互作用机制分析

• 发表时间: 2015
• 作者: 宮崎 亮次;由良 隆; 鈴木 健裕;堂前 直;森 博幸;秋山 芳展
• 通讯作者: 秋山 芳展

熱ショック転写因子σ32とシグナル認識粒子の相互作用

热激转录因子σ32与信号识别粒子的相互作用

• 发表时间: 2015
• 作者: 宮崎 亮次;由良 隆; 鈴木 健裕;堂前 直;森 博幸;秋山 芳展
• 通讯作者: 秋山 芳展