ボツリヌス毒素複合体の宿主侵入機構に関する構造生物学的研究

肉毒毒素复合物入侵宿主机制的结构生物学研究

基本信息

批准号：
15J03770
负责人：
阿松翔
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度から引き続きマウス小腸組織免疫染色の条件検討を行った結果、凍結切片を用いた免疫染色により膜タンパク質Xを染色することができた。培養細胞の結果と一致して、上皮細胞に取り込まれたHAは膜タンパク質Xと共局在した。この結果から、膜タンパク質Xは、in vitroだけでなくin vivoでもHAの細胞内取り込みに関与することが示唆された。しかし現染色条件は、陽性コントロールとして試したマウス肝臓組織切片では膜タンパク質X特異的な綺麗な染色像を示したが、マウス小腸組織切片では膜タンパク質Xに加えて非特異的染色が散見されるため、染色条件の改良やノックアウトマウスを用いた確認が必須である。CRISPR/Cas9システムを用いた膜タンパク質X欠損Caco-2細胞の作製では、数種のリポフェクション試薬を検討したが、どれもCaco-2細胞に対する遺伝子導入効率が低かったためまだ欠損細胞を作製できていない。再度条件検討を行った結果、エレクトロポレーション法を用いることでCaco-2細胞でも約80%の割合でGFP陽性細胞を得ることができた。現在、エレクトロポレーション法により欠損細胞の作製を行っている。ヒト大腸がん由来細胞株Caco-2細胞を用いてライセートを作製し、プルダウン法でHAと膜タンパク質Xの結合を解析した。前年度に実施したマウス小腸組織ライセートからプルダウンを行った結果と一致して、細胞ライセートから膜タンパク質XはHA特異的に共沈殿した。これまでに報告されているガラクトース、シアル酸又はE-カドヘリンに結合しないHAの各種変異体を用いて細胞ライセートからプルダウンを行った結果、ガラクトースに結合しない変異によって膜タンパク質Xはほとんど共沈殿しなくなった。これらの結果から、HAはヒト膜タンパク質Xと糖鎖依存的に相互作用をすることが明らかになった。

继去年之后，我们继续研究了小鼠小肠组织免疫染色的条件，结果，我们能够通过使用冷冻切片的免疫染色对膜蛋白X进行染色。与培养细胞中的结果一致，上皮细胞摄取的透明质酸与膜蛋白 X 共定位。这些结果表明膜蛋白 X 不仅在体外而且在体内参与透明质酸的细胞摄取。然而，在目前的染色条件下，作为阳性对照的小鼠肝脏组织切片显示出清晰的膜蛋白X特异的染色图像，而小鼠小肠组织切片除了膜蛋白X外还显示出一些非特异性染色。因此，有必要改善染色条件并使用敲除小鼠进行确认。研究了几种类型的脂转染试剂用于生产缺乏膜蛋白的 Caco-2 细胞。重新研究条件的结果是，通过使用电穿孔法，即使在Caco-2细胞中，也能够以约80%的比例获得GFP阳性细胞。目前，我们正在使用电穿孔生产有缺陷的细胞。使用 Caco-2 细胞（一种源自人结肠癌的细胞系）制备裂解物，并使用 Pull-down 方法分析透明质酸和膜蛋白 X 之间的结合。与前一年从小鼠小肠组织裂解液中提取的结果一致，膜蛋白 X 与细胞裂解液中的 HA 特异性共沉淀。使用迄今为止报道的不与半乳糖、唾液酸或 E-钙粘蛋白结合的各种透明质酸突变体从细胞裂解液中下拉，得到膜蛋白 Ta。这些结果表明透明质酸以糖链依赖性方式与人膜蛋白 X 相互作用。