スフィンゴ脂質の合成・分解両経路に関わるＴＥＲの機能解析

TER 参与鞘脂合成和降解途径的功能分析

• 批准号: 15J02525
• 负责人: 安部 健介
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J02525/
• 关键词: 脂質生化学; スフィンゴ脂質; 極長鎖脂肪酸; スフィンゴシン1-リン酸

TERによる極長鎖脂肪酸合成経路制御機構の解析のため，出芽酵母を用いた系を構築した。これまでにTERの極長鎖脂肪酸合成酵素との結合に必要なアミノ酸残基は不明であったため，アミノ酸配列が既知のTERホモログで保存されたアミノ酸残基に着目し，その残基をアラニンに置換した変異体を作製した。また，シロイヌナズナTERホモログではTERの141番目のアルギニン（R141）に相当する残基のアラニンに置換体は出芽酵母TERホモログTSC13遺伝子欠損を相補しないことが知られている。そのため，TERのR141に対してアラニン置換体と嵩高いチロシンに置換した変異体（R141Y）を作製した。作製したTER変異体を野生型HACDと共にTSC13遺伝子欠損株に形質転換した。解析の結果，R141Y変異体はHACDの安定性を著しく低下させることを見出し，TERのHACDとの相互作用に必要なアミノ酸残基が明らかとなった。本結果からTERによる極長鎖脂肪酸合成制御機構が新たに明らかとなった。前年度はTERLに飽和脂肪酸伸長活性がないことを示したので，本年度は不飽和脂肪酸伸長活性測定系を構築した。酵母伸長サイクルは不飽和脂肪酸を伸長しないため，前年度に作製したTERL導入TSC13欠損株に不飽和脂肪酸縮合活性を持つヒトELOVLを導入した。測定系の構築は完了したが，辞退となったため，詳細な解析に至らなかった。また，生体におけるTERLの役割を明らかにするため，CRISPR/Cas9システムを用いたTerl遺伝子ノックアウトマウス作成を行った。作製したキメラマウスと野生型マウスとの交配によってTerlヘテロノックアウトマウスを作製した。作製したヘテロマウスは野生型対立遺伝子によって野生型と同様の表現型を示した。TERLホモノックアウトマウスの作製，解析によって生体での役割が明らかになることが期待される。

为了分析使用TER的超长链脂肪酸合成的途径控制机理，构建了使用芽酵母的系统。到目前为止，与TER的极长链脂肪酸合酶结合所需的氨基酸残基尚不清楚，因此我们专注于氨基酸残基的氨基酸残基，其氨基酸序列在已知的TER同源物中保守，并创建了一个突变体，其中残基在其中替换为丙氨酸。还众所周知，在拟南芥中同源物中，在TER的位置141的精氨酸（R141）的残基上取代了丙氨酸，并不能补充糖酵母酵母Ter Ter同源物中有缺陷的TSC13基因。因此，在TER中的R141被丙氨酸取代并产生了笨重的酪氨酸的突变体（R141Y）。将产生的TER突变体与野生型HaCD一起转化为TSC13基因缺陷株。分析表明，R141Y突变体显着降低了HACD的稳定性，揭示了与HaCD相互作用所需的氨基酸残基。这些结果揭示了一种新的机制来控制TER合成超长链脂肪酸的合成。在上一年，TERL表明没有饱和脂肪酸的伸长活性，因此今年我们构建了一个用于测量不饱和脂肪酸伸长活性的系统。由于酵母的延伸周期不会拉长不饱和脂肪酸，因此将具有不饱和脂肪酸凝结活性的人Elovl引入了上一年产生的TERL引入的TSC13缺陷型菌株中。测量系统的构建完成了，但公司拒绝了，尚未进行详细的分析。此外，为了阐明Terl在生物体中的作用，我们使用CRISPR/CAS9系统创建了Terl Gene敲除小鼠。通过将制备的嵌合小鼠与野生型小鼠配对制备Terl Heteroknockout小鼠。由于野生型等位基因，产生的异质小鼠表现出与野生型相似的表型。预计TERL同型小鼠的生产和分析将揭示其在生物体中的作用。

项目成果

Biochemical analysis of the mutation for non-syndromic mental retardation in the trans-2-enoyl-CoA reductase TER gene involved in fatty acid elongation

参与脂肪酸延伸的反式2-烯酰辅酶A还原酶TER基因突变的生化分析

• 发表时间: 2015
• 作者: Abe K;Wakashima T;Ohno Y;Kihara A
• 通讯作者: Kihara A