骨関節組織におけるシスチン/グルタミン酸アンチポーターの機能解析

骨和关节组织中胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白的功能分析

基本信息

批准号：
08J05726
负责人：
宇野恭介
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度までの研究により、骨芽細胞においては高濃度の細胞外グルタミン酸(Glu)により、Xc^-輸送系の逆行性輪送活性が亢進して、増殖性が抑制されるという結果を得た。また、MC3T3-E1細胞にxCT遺伝子を強制発現することにより細胞の増殖能は強制発現細胞においてコントロール群に比べて有意な上昇が確認された。さらに強制発現細胞では、骨芽細胞分化能は有意な抑制が確認された。本年度はxCT強制発現細胞を用いさらなる解析を行った。xCT強制発現細胞およびコントロールとして空ベクターを導入した細胞を用い、[^<14>C]標識されたシスチンを用いて、シスチンの取り込み活性を測定した。その結果、強制発現細胞においてはシスチンの取り込み能の著明な上昇が確認された。また、強制発現細胞においては骨芽細胞分化過程の抑制が確認されたので、マスターレギュレーターであるRunx2のdeletion constractを作成し、その転写能について検討を行ったところ、転写開始点上流976bp付近で有意な抑制が確認された。またこれは一過性の発現ベクターを用いた場合でも同様の結果が得られた。さらに、MC3T3-E1へ一過性にxCT発現ベクターを導入した際にも、MTT還元能の上昇ならびに、Runx2タンパク質の発現減少が確認されたのに対し、xCTのsiRNAを導入した際には、MTT還元能の減少ならびに、Runx2タンパク質の発現上昇が確認された。また、OVXマウスの大腿骨および脛骨より、totalRNAおよびタンパク質を回収したところ、OVXマウスにおいては、xCTのタンパク質、mRNAいずれにおいても著明な発現上昇が確認された。これらの結果より、xCTの機能を抑制することにより、骨粗鬆症治療につながる可能性が示唆される。

去年进行的研究表明，在成骨细胞中，高浓度的细胞外谷氨酸 (Glu) 增强 Xc^-转运系统的逆行转运活性并抑制增殖。此外，通过在MC3T3-E1细胞中强制表达xCT基因，证实与对照组相比，强制表达细胞中的细胞增殖能力显着增加。此外，在强制表达的细胞中，证实了成骨细胞分化能力的显着抑制。今年，我们使用 xCT 强制表达细胞进行了进一步分析。使用xCT强制表达细胞和用空载体转染的细胞作为对照，使用[ 14 C]标记的胱氨酸测量胱氨酸摄取活性。结果，在强制表达细胞中确认了胱氨酸摄取能力的显着增加。此外，我们证实在强制表达的细胞中成骨细胞分化过程受到抑制，因此我们创建了主调控因子Runx2的缺失构建体，并检查了其转录能力，证实了其显着抑制。当使用瞬时表达载体时也获得了类似的结果。此外，当将xCT表达载体瞬时导入MC3T3-E1时，证实了MTT还原能力的增加和Runx2蛋白表达的减少，而当导入xCT siRNA时，MTT还原能力的降低和Runx2蛋白表达的增加被证实。此外，当从 OVX 小鼠的股骨和胫骨收集总 RNA 和蛋白质时，证实 OVX 小鼠中 xCT 蛋白和 mRNA 的表达显着增加。这些结果表明抑制 xCT 的功能可能有助于治疗骨质疏松症。