シェーグレン症候群の発症における分子機構解析

干燥综合征发病的分子机制分析

基本信息

批准号：
08J00077
负责人：
中村友美
金额：
$ 1.15万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2010
项目状态：
已结题

项目摘要

M3Rは4つの細胞外領域を有する受容体であり、唾液・涙液分泌に関与する。口腔および眼における乾燥症状を主体とするシェーグレン症候群患者血清中には、4つの細胞外領域に対する自己抗体が認められており、特に第二細胞外領域に対する自己抗体は細胞内シグナル抑制的な機能を有することを示した。他の自己抗体の存在および抗M3R抗体自体の量的な影響を除外できないため、M3R特異的なモノクローナル抗体を作製と機能解析を検討した。まず最初に、生物活性の中心である第二細胞外領域25mer (M3R_<25>)に対するモノクローナル抗体作製より着手した。M3R_<25>の合成ペプチドと等量のCFAで作製したエマルジョンを6週齢のC57BL/6マウスに2週間毎計3回免疫後、脾臓とマウスミエローマ細胞株を細胞融合し、HAT選択培地でコロニーのピックアップを行った。ELISA法にてスクリーニングし、M3R_<25>特異的なハイブリドーマのみを大量培養し、培養上清から抗M3R_<25>モノクローナル抗体を精製した。細胞融合は2回行い、4つのクローンを得ることができた。抗体のアイソタイプはいずれもIgG2b・Kであった。このモノクローナル抗体は、ウエスタンブロット法にてヒトリコンビナントM3R蛋白(hrM3R)と結合した。さらに、機能解析の実験として4種類のモノクローナル抗体をHSG細胞と12時間共培養させた後、M3R特異的アゴニストである塩酸セビメリンを添加したときの細胞内カルシウム濃度を蛍光プレートリーダーで測定したところ、すべての抗M3R_<25>モノクローナル抗体において細胞内シグナルを抑制する傾向が認められた。また、4クローンのV領域(CDR3)におけるアミノ酸配列のシークエンスを行ったところ、4クローンのうち3クローンは同一クローンであり、2種類のハイブリドーマ細胞を得たことが判明した。以上のことから、M3R_<25>モノクローナル抗体は、唾液腺組織において唾液分泌を抑制する可能性が考えられた。

M3R 是一种具有四个细胞外结构域的受体，参与唾液和泪液的分泌。在干燥综合征患者的血清中发现了针对四个细胞外区域的自身抗体，其主要症状是口腔和眼睛干燥。特别是针对第二个细胞外区域的自身抗体具有抑制细胞内信号的功能。确实如此。由于我们不能排除其他自身抗体的存在以及抗M3R抗体本身的定量影响，因此我们制备了M3R特异性单克隆抗体并检查了其功能分析。首先，我们首先创建针对第二个胞外区域 25mer (M3R_<25>) 的单克隆抗体，该区域是生物活性的中心。用M3R_<25>合成肽和等量CFA制备的乳剂每两周免疫6周龄C57BL/6小鼠3次，使脾脏和小鼠骨髓瘤细胞系融合，将细胞我用 HAT 选择培养基培养了一个菌落。使用ELISA法进行筛选，仅大量培养M3R_ 25 特异性杂交瘤，并从培养上清液中纯化抗M3R_ 25 > 单克隆抗体。进行两次细胞融合，获得4个克隆。所有抗体的同种型为 IgG2b/K。通过蛋白质印迹法将该单克隆抗体与人重组 M3R 蛋白 (hrM3R) 结合。此外，作为功能分析实验，将四种类型的单克隆抗体与HSG细胞共培养12小时，并使用荧光板读数器测量当添加M3R特异性激动剂盐酸西维美林时的细胞内钙浓度。抗M3R_ 25 单克隆抗体倾向于抑制细胞内信号。此外，当对4个克隆的V区(CDR3)的氨基酸序列进行测序时，发现4个克隆中的3个是相同的克隆，并且获得了两种类型的杂交瘤细胞。基于上述，认为M3R_ 25 单克隆抗体可以抑制唾液腺组织中的唾液分泌。