計画的ネクローシスにより誘導される生体応答機構の解明

阐明计划性坏死引起的生物反应机制

基本信息

批准号：
14J12413
负责人：
進藤綾大
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Juntendo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

CFLARs Tgマウスの腸管ではアポトーシスやネクロプトーシスが亢進している他、本細胞死はRIPK3の欠損によってレスキューされる。しかしながら、両細胞死が独立して誘導されているかは不明であった。Tg;Mlkl-/-マウスにおける活性型カスパーゼ3(CC3)抗体による免疫染色を行ったところMlklの欠損によりCC3陽性シグナルが減弱した。このことからネクロプトーシスがまず誘導され、その後アポトーシスが誘導されると考えられる。また胎生期には発現していないReg3bと呼ばれるタンパク質の増加が認められ、Reg3bは死細胞ではなく生細胞からのシグナルを受けた杯細胞が産生することが判明している。Il22 KOマウスおよび Rorc KOマウスを用いた解析から、成獣小腸においてReg3βの産生はtype 3 innate lymphoid cell(ILC3)から産生されIL-22に依存することが判明した。胎生18.5日目のCFLARs Tg;Rorcgfp/gfpマウスにおいてもIl22およびReg3bの発現の消失が認められた。続いてαGFP抗体およびαReg3β抗体を用いた二重染色の結果、CFLARs Tg;Rorcgfp/+マウスでのみReg3β陽性細胞の周囲にGFP陽性細胞の集簇が認められることが判明した。このことから細胞死の亢進に伴い、産生ないしは分泌される因子がRORγt陽性細胞のリクルートを誘導していることが示唆される。以上から、CFLARs TgマウスのReg3β産生はRORγt陽性ILC3に依存すると考えられる。Reg3βの機能を解析するためにCrispr/Cas9法を用いReg3b KOマウスを樹立した。Reg3b KOマウスとCFLARs Tgマウスとの交配を試みたところ、CFLARs Tgマウスの表現型はレスキューされなかった。

除了CFLARS TG小鼠肠道中的凋亡和坏死性增加外，该细胞死亡还被RIPK3缺乏挽救。但是，目前尚不清楚两种细胞死亡是否都是独立诱导的。用Tg; MLKL - / - 小鼠在活性caspase 3（CC3）抗体中进行免疫染色，导致CC3阳性信号由于MLKL缺乏而导致。这表明首先诱导坏死性，然后凋亡。此外，在胎儿阶段观察到了未表达的称为Reg3b的蛋白质增加，并且发现Reg3b是由接收来自活细胞而不是死细胞信号的杯状细胞产生的。使用IL22 KO和RORC KO小鼠的分析表明，成年小肠中Reg3β的产生是由3型先天淋巴样细胞（ILC3）产生的，并依赖于IL-22。在胚胎寿命第18.5天，在CFLARS TG; RORCGFP/GFP小鼠中也观察到IL22和REG3B表达的消失。随后，使用αGFP和αReg3β抗体进行双重染色表明，仅在CFLARS TG中，在Reg3β阳性细胞周围观察到GFP阳性细胞的积累； RorCGFP/+小鼠。这表明，随着细胞死亡的增加，产生或分泌的因素会诱导RORγT阳性细胞的募集。从上面可以看出，CFLARS TG小鼠中的Reg3β产生取决于RORγT阳性ILC3。为了分析REG3β的功能，使用CRISPR/CAS9方法建立了REG3B KO小鼠。当尝试用CFLARS TG小鼠穿越Reg3b KO小鼠时，未营救CFLARS TG小鼠的表型。