近位尿細管エンドサイトーシスによる新規レニン・アンジオテンシン系活性化機構の解明

通过近端肾小管内吞作用阐明新型肾素-血管紧张素系统激活机制

基本信息

批准号：
23790934
负责人：
佐藤博慶
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Niigata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の主目的は、腎近位尿細管細胞に発現するエンドサイトーシス受容体メガリンを介する新しいレニン-アンジオテンシン系の活性化機構を明らかにすることである。アンジオテンシンIIの前駆タンパクであるアンジオテンシノゲンは、糸球体を濾過した後、メガリンを介して近位尿細管上皮細胞に取り込まれることが知られている。本年度は、InvitrogenのFreeStyle MAX 293 Expression Systemを用いて、浮遊・高密度培養可能なHEK293細胞に、ヒトアンジオテンシノゲンおよびヒトプロレニンcDNA(Hisタグ付き)を組み込んだ発現ベクターをトランスフェクションし、無血清培地中にそれらの組換えタンパクを発現させた後、コバルトカラムで精製することにより、それらのタンパクを大量に精製することに成功した。上記の方法で作製した組換えヒトアンジオテンシノゲンとヒトプロレニンを、培養ラット近位尿細管上皮細胞(IRPTC)に添加したところ、細胞内に取り込まれたヒトアンジオテンシノゲンがヒトプロレニンにより切断されることを見出した。すなわちこれは、細胞内でヒトプロレニンが活性化されたことを示す。さらに、試験管内の反応において、酸性pH条件下でヒトプロレニンが活性化することを確認しており、IRPTC内のエンドソームの酸性pHによりプロレニンが活性化したものと考えられた。さらに、私が所属する新潟大学大学院医歯学総合研究科機能分子医学講座では高効率の腎特異的メガリンノックアウトマウスの作出に新たに成功した。このマウスの尿には大量のアンジオテンシノゲン(レニン未切断型)が存在することから、糸球体を濾過したアンジオテンシノゲン(レニン未切断型)が、メガリンを介して近位尿細管上皮細胞に取り込まれることが示唆された。

本研究的主要目的是阐明肾近端肾小管细胞表达的内吞受体巨蛋白介导的肾素-血管紧张素系统的新激活机制。已知血管紧张素原是血管紧张素II的前体蛋白，在滤过肾小球后通过巨蛋白被近端肾小管上皮细胞吸收。今年，我们使用 Invitrogen 的 FreeStyle MAX 293 表达系统转染 HEK293 细胞，该细胞可在悬浮液中高密度培养，表达载体掺入人血管紧张素原和人肾素原 cDNA（带有 His 标签），通过在细胞中表达这些重组蛋白。血清培养基，然后用钴柱纯化它们，我们成功地纯化了大量这些蛋白质。当将通过上述方法产生的重组人血管紧张素原和人肾素原添加到培养的大鼠近端肾小管上皮细胞(IRPTC)中时，摄入到细胞中的人血管紧张素原被人肾素原裂解。也就是说，这表明人肾素原在细胞内被激活。此外，体外反应证实人肾素原在酸性pH条件下被激活，这表明IRPTC内内体的酸性pH可激活肾素原。此外，我所属的新泻大学医学牙科研究生院功能分子医学系最近成功培育出高效的肾脏特异性巨蛋白敲除小鼠。由于这些小鼠的尿液中存在大量的血管紧张素原（未裂解的肾素），因此通过肾小球过滤的血管紧张素原（未裂解的肾素）通过巨蛋白转移至近端肾小管上皮，这表明其被细胞摄取。。