繊毛／鞭毛内腕ダイニンの規則的周期性を規定する因子の探索

寻找调节纤毛/鞭毛内臂动力蛋白规则周期性的因素

基本信息

批准号：
14J00436
负责人：
山本遼介
金额：
$ 1.91万
依托单位：
Osaka University (2015)University of Tsukuba (2014)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J00436/
关键词：
繊毛内腕ダイニン pf23 周期性鞭毛クラミドモナス

项目摘要

昨年度に引き続いて、繊毛内腕ダイニンの規則的周期性形成の機構を探るため、クラミドモナスの既知変異株で最も内腕ダイニン欠損が大きいと考えられる変異株(pf23株)の解析を行った。第1に、pf23株での内腕ダイニンの欠損種を半定量的に決定するため、昨年度より引き続き質量分析計を用いたSpectral Counting法により、pf23株繊毛ダイニン存在量を野生型と比較した。現在までの報告とは異なり、pf23株はaからgまで存在する7種のメジャー内腕ダイニン種のうち、ダイニン種aを除く6種のダイニン種が野生型の20%以下にまで減少していることが明らかになった。第2に、pf23株の原因タンパク質であるPF23pの機能ドメインについて解析を行った。PF23pの全長cDNAの配列決定により、PF23pはN末端側にCS domainを、C末端側に5つのTPR motifを持つタンパク質であることが明らかになった。特定の変異株の解析から、PF23pのC末端側の2つのTPR motifはPF23pの機能に必須では無いことが示唆された。第3に、PF23pの細胞質内での相互作用相手を決定するために、HAタグ付きPF23pを発現するpf23株レスキュー株を用いて細胞質の免疫沈降実験を行った。結果として、複数のFAP(Flagellar Associated Protein)やHeat Shock Protein等、興味深い相互作用相手の候補が同定された。第4に、クライオ電子顕微鏡法を用いてpf23株軸糸の3次元再構成を行った。Spectral Counting法を用いて測定された各種ダイニンの繊毛内存在量結果を支持するように、ダイニン種aのdensityだけが再構成像から明確に確認できた。現在、これらの結果を投稿論文として纏めている。

去年，为了探讨定期定期形成腹膜内动力蛋白的机制，我们分析了突变菌株（PF23），这被认为是衣原体中已知的突变体中最大的内臂动力蛋白缺乏。首先，为了半高量式确定PF23菌株中动力蛋白缺陷的种类，使用连续的精子光谱仪，使用质谱仪将纤毛动力蛋白的丰度与野生型进行了比较。与以前的报道不同，已经揭示了PF23菌株中存在的七个主要内臂动力蛋白物种，除了动力蛋白A外，六种动力蛋白种类降低到野生型的20％。其次，分析了PF23P的功能结构域，PF23菌株的致病蛋白。 PF23P的全长cDNA的测序表明，PF23P是一种蛋白质，在N末端具有CS结构域，在C-terminus处进行了五个TPR基序。对特定突变菌株的分析表明，PF23P C末端的两个TPR基序对于PF23P的功能并不是必需的。第三，为了确定PF23P的细胞质相互作用伴侣，使用表达HA标记的PF23P的PF23菌株救援菌株进行了细胞质免疫沉淀实验。结果，确定了多个有趣的相互作用伙伴，例如FAP（鞭毛相关蛋白）和热休克蛋白。使用冷冻电子显微镜进行了PF23应变轴向螺纹的第四维重建。只能从重建图像中清楚地证实动力蛋白物种的密度，从而支持使用光谱计数方法测量的各种动力蛋白的内部丰度的结果。目前，这些结果总结为提交的论文。