繊毛運動の三次元計測による軸糸内腕ダイニンの繊毛波形調節機構の解明

通过纤毛运动的三维测量阐明轴丝臂动力蛋白的纤毛波形调节机制

基本信息

批准号：
14J09628
负责人：
山口真
金额：
$ 1.22万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

繊毛運動の駆動におけるダイニンの機能を定量するため、テトラヒメナ一繊毛の運動を可視化、計測できる実験系の開発、計測、及び軸糸ダイニンの一部を欠損したテトラヒメナの作製を行った。まずテトラヒメナ細胞表面をビオチン修飾し、これにアビジンで修飾した蛍光ビーズを付加することで繊毛を計測するプローブとした。次にこのテトラヒメナの繊毛運動を計測するため、マイクロピペット、マニピュレーター、及びインジェクターを用いた実験系を構築し、適当な陰圧により溶液を吸引することでマイクロピペット先端に生きたテトラヒメナを固定した。このテトラヒメナについて、繊毛表面に付加された蛍光ビーズの運動を三次元位置検出光学系を用いて計測することで、繊毛一本の運動を計測することができた。これにより、従来は往復運動をしていると考えられていた繊毛運動が、回転運動であることが明らかになった。現在、計測数を増やすことで繊毛運動の速度や波形の解析を進めている。また軸糸ダイニンの一部を欠損したテトラヒメナを作製した。これには、内在のダイニン遺伝子配列と組み替わり薬剤耐性遺伝子を挿入する遺伝子断片を金粒子に付加し、遺伝子銃によりテトラヒメナに打ち込む方法を用いた。テトラヒメナは大核中に同じ遺伝子を複数コピー持ち、この段階では内在性の遺伝子配列が残っているため、薬剤濃度を上げながら継代することで全てのコピーが組み換えられた変異体を選別する作業を現在おこなっている。これが終わり次第、上記の実験系を用いて軸糸ダイニンの欠損が繊毛運動に与える影響を解析する計画である。

为了量化动力蛋白在驱动纤毛运动中的功能，我们开发了一个实验系统，该系统可以可视化和测量纤毛的运动，并测量四氢烷的运动，并产生四氢烷，这缺乏圆柱形染色蛋白的一部分。首先，对四膜细胞的表面进行了生物素的修饰，并将用阿维丁修饰的荧光珠添加到探针中以测量纤毛。接下来，为了测量四膜虫的纤毛运动，构造了使用微型夹板，操纵器和注射器的实验系统，并通过在适当的负压下吸入溶液，将活的四膜固定在微管尖端上。使用该四膜虫，使用三维位置检测光学系统测量添加到纤毛表面的荧光珠的运动，从而可以测量一个纤毛。这表明苏里亚运动以前被认为是回报的，是旋转运动。当前，我们正在通过增加测量数量来分析纤毛运动的速度和波形。此外，制备了四膜虫部分缺失的动力蛋白。这涉及添加一个基因片段，该基因片段将内源性动力蛋白基因序列与耐药性基因替换为金颗粒，然后使用基因枪将其植入四氢体。四膜虫在大核中具有多个同一基因的副本，在此阶段仍然有一个内源基因序列，因此我们目前正在选择选择突变体的突变体，这些突变体的拷贝已通过传递重组，同时增加了药物的浓度。一旦完成，我们计划使用上述实验系统来分析圆柱动力蛋白对纤毛运动的缺陷的影响。