肝細胞における遊離コレステロールの毒性発現機構

游离胆固醇对肝细胞的毒性机制

• 批准号: 17K08295
• 负责人: 牧野 麻美
• 金额: $ 3.08万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-04-01 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17K08295/
• 关键词: コレステロール; 脂肪滴; 肝細胞; 中性脂質

私たちは培養肝細胞Huh7を用い、アシルコレステロール・アシルトランスフェラーゼ（ACAT）阻害剤、(1s,2s)-2-[3-(2,2-dimethylpropyl)-3-nonylureido]aminocyclohexane-1-yl 3-[N-(2,2,5,5-tetramethyl-1,3-dioxane-4-carbonyl)amino]propionate (F1394)を加えることにより細胞内の遊離コレステロールを上昇させると、低分子量Gタンパク質、Rab18活性に依存して脂肪滴と小胞体の融合が起こることを見出した（Makino et al. Mol Biol Cell 27, 3293(2016)）。遊離コレステロールの導入に利用されるメチル-b;-シクロデキストリンとコレステロールとの複合体（Mb;CD/Chol）をF1394と併用すると細胞死が観察される。この実験系を用い、siRNAライブラリーを用いて不活性化すると細胞死を起こさないタンパク質の検索を行い、Golgi associated, gamma adaptin earcontaining, ARF binding protein 2 (GGA2)、sphingosine-1-phosphate phosphatase 1 (SGPP1)、Rab18、ADP ribosylation factor 1 (ARF1)、inositol polyphosphate-5-phosphatase K (INPP5K)の５つのタンパク質を同定した。本研究では脂肪滴のサイズを正確に測定することが求められる。これまで私たちは精製した脂肪滴のサイズ測定には光散乱を用いていたが、光散乱は粒子サイズが不均一の場合誤差が大きいため、個々の脂肪滴のサイズを測定できるナノ粒子マルチアナライザーを導入した。

我们使用培养的肝细胞 Huh7 并用酰基胆固醇酰基转移酶 (ACAT) 抑制剂 (1s,2s)-2-[3-(2,2-二甲基丙基)-3-壬基脲基]氨基环己烷-1-基 3 对其进行处理。-[N -(2,2,5,5-四甲基-1,3-二恶烷-4-羰基)氨基]丙酸酯我们发现，当通过添加（F1394）增加细胞内游离胆固醇时，脂滴和内质网的融合发生取决于低分子量G蛋白Rab18的活性（Makino等人，Mol Biol Cell 27，3293（2016）） ）。当用于引入游离胆固醇的甲基-b;-环糊精和胆固醇(Mb;CD/Chol)的复合物与F1394组合使用时，观察到细胞死亡。使用该实验系统，我们使用 siRNA 文库来搜索失活时不会导致细胞死亡的蛋白质（SGPP1）、Rab18、ADP 核糖基化因子 1 (ARF1)、肌醇多磷酸-5-磷酸酶 K。我们鉴定了五种蛋白质 (INPP5K)。这项研究需要准确测量脂滴尺寸。到目前为止，我们一直使用光散射来测量纯化的脂滴的尺寸，但由于光散射在粒径不均匀时误差较大，因此我们开发了纳米颗粒多功能分析仪，可以测量单个脂滴的尺寸介绍。

项目成果

A novel spingomyeling/cholesterol specific probe reveals the dynamics of the membrane domain during virus and in Nieman-Pick type C

一种新型鞘磷脂/胆固醇特异性探针揭示了病毒期间和 Nieman-Pick C 型细胞膜结构域的动态

• DOI: 10.1096/fj.201500075r
• 发表时间: 2016
• 作者: Makino; A.; Sako; Y. et al.
• 通讯作者: Y. et al.

Photoswitchable phospholipid FRET acceptor: Detergent free intermembrane transfer assay of fluorescent lipid analogs

光开关磷脂 FRET 受体：荧光脂质类似物的无去垢剂膜间转移测定

• DOI: 10.1038/s41598-017-02980-x
• 发表时间: 2017-06-06
• 影响因子: 4.6
• 作者: Sumi M;Makino A;Inaba T;Sako Y;Fujimori F;Greimel P;Kobayashi T
• 通讯作者: Kobayashi T

Phospholipase C beta1 induces membrane tubulation and is involved in caveola e formation

磷脂酶 C beta1 诱导膜管化并参与小窝形成

• 发表时间: 2017
• 作者: Toshihide Kobayashi; Takehiko Inaba; Takuma Kishimoto; Motohide Murate; Takuya Tajima; Mitsuhiro Abe; Asami Makino; Nario Tomishige; Shinji Takeoka
• 通讯作者: Shinji Takeoka

Phospholipase Cb1 induces membrane tubulation and is involved in caveolae formation

磷脂酶 Cb1 诱导膜管化并参与小窝形成

• 发表时间: 2017
• 作者: Takehiko Inaba; Takuma Kishimoto; Motohide Murate; Takuya Tajima; Shota Sakai; Mitsuhiro Abe; Asami Makino; Nario Tomishige; Reiko Ishitsuka; Yasuo Ikeda; Shinji Takeoka;Toshihide Kobayashi
• 通讯作者: Toshihide Kobayashi

A NOVEL SPHINGOMYELIN/CHOLESTEROL DOMAIN-SPECIFIC PROBE REVEALS THE DYNAMICS OF THE MEMBRANE DOMAINS DURING VIRUS RELEASE AND IN NIEMANN-PICK TYPE C

新型鞘磷脂/胆固醇域特异性探针揭示了病毒释放期间和 NIEMANN-PICK C 型中膜域的动态

• 发表时间: 2017
• 作者: Makino A; Abe M; Ishitsuka R; Murate M; Kishimoto T; Sakai S; Hullin;Kobayashi T
• 通讯作者: Kobayashi T