Retinal Regeneration using iris derived retinal stem cell

使用虹膜来源的视网膜干细胞进行视网膜再生

基本信息

批准号：
19700324
负责人：
YAMAMOTO Naoki
金额：
$ 2.42万
依托单位：
Fujita Health University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19700324/
关键词：
虹彩組織細胞網膜幹前駆細胞再生医療網膜再生 p75NTR CD271 Nestin p75NGFR 網膜幹細胞

项目摘要

研究代表者の山本が特許を取得している固定液を用いてマウス虹彩組織を固定し、in vivoにおける免疫組織染色による詳細な調査を行った。その結果、神経幹/前駆細胞マーカーの1つであるNestin を発現している細胞が存在することを明らかとした。さらに、山本が発見し、特許出願・審査中の新しい網膜幹/前駆細胞マーカーであるp75NTR(CD271)を用いて、同様に虹彩組織の免疫組織染色を行ったところ、Nestin陽性の細胞はp75NTR陽性の細胞であることが判明した。次に従来から神経系幹細胞の培養方法として知られているNeurosphere法で虹彩組織細胞を培養したところ、Sphereを形成した細胞はNestin とp75NTRが陽性の細胞であった。しかし、虹彩由来細胞は、Neurosphere法では継代培養することができなかったため、新しいマウス虹彩組織の培養条件を検討したところ、bFGFを添加することで虹彩組織に含まれる色素顆粒の脱顆粒を誘導し、かつin vitroのシャーレ内でp75NTR 発現細胞を培養・増殖できることが分かった。さらに、マウス虹彩組織から培養した細胞(マウス虹彩由来網膜幹/前駆細胞 Mouse Iris derived Retinal Stem Cell:M-IRSC)について、p75NTRによる細胞分離を試みた。このM-IRSCから選択分離したp75NTR(+) Cellsとp75NTR(-) Cellsについて、レチノイン酸を含む網膜細胞への分化誘導培地で培養し、比較検討したところp75NTR(+) Cells から網膜細胞へ分化誘導することで、効率的にRhodopsinとRecoverin陽性の視細胞、Calbindin陽性の水平細胞、およびPKC陽性の双極細胞へ分化誘導できることをリアルタイムPCRによるm-RNAの発現定量実験、および細胞免疫染色で確認できた。

使用主要研究者山本专利的固定液固定小鼠虹膜组织，并使用体内免疫组织化学染色进行详细研究。结果显示，有细胞表达巢蛋白（一种神经干/祖细胞标记物）。此外，当我们使用山本发现的新视网膜干/祖细胞标记物p75NTR（CD271）对虹膜组织进行类似的免疫组织化学染色时，我们发现巢蛋白阳性细胞是p75NTR阳性的。发现细胞是接下来，当使用传统的神经干细胞培养方法Neurosphere方法培养虹膜组织细胞时，形成球体的细胞呈Nestin和p75NTR阳性。然而，虹膜来源的细胞无法使用 Neurosphere 方法进行传代培养，因此我们研究了小鼠虹膜组织的新培养条件，发现添加 bFGF 会诱导虹膜组织中含有的色素颗粒脱颗粒。此外，还发现 p75NTR-。表达细胞可以在体外培养皿中培养和增殖。此外，我们尝试使用 p75NTR 分离从小鼠虹膜组织（小鼠虹膜来源的视网膜干细胞：M-IRSC）培养的细胞。从这些M-IRSCs中选择性分离的p75NTR(+)细胞和p75NTR(-)细胞在含有视黄酸的视网膜细胞分化诱导培养基中培养，比较研究表明p75NTR(+)细胞使用实时PCR定量mRNA表达的实验表明，通过诱导分化为视网膜细胞，我们可以有效诱导分化为视紫红质和恢复蛋白阳性感光细胞、钙结合蛋白阳性水平细胞和PKC阳性双极细胞。通过细胞免疫染色。