宿主染色体との協調的相互作用による分解プラスミドのゲノム機能に関する研究

通过与宿主染色体的协同相互作用研究降解质粒的基因组功能

基本信息

批准号：
07J03864
负责人：
宮腰昌利
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

IncP-7群トルエン分解プラスミドpDK1はPseudomonas属細菌で安定に保持されたが、例外的にKT2440株では極度に不安定である。KT2440株においてparIの遺伝子破壊によりミニプラスミドの安定性が向上し、一方でP.fluorescens Pf-5株においてparIをLacI^q制御下にあるtacプロモーターから発現させたところIPTG濃度依存的にミニプラスミドは不安定化した。以上から、ParIがIncP-7群プラスミドの分配を阻害するKT2440株特異的宿主因子であることが明らかになった。また、セントロメア様配列parSの数が多いほどParIによる不安定化の影響を受けやすいことが示された。次に、ParIの分配阻害活性にはParIのATPaseドメインが必須であることが示された。また、ParBのR-fingerと考えられるArg93をLys、Alaに置換することでミニプラスミドの安定性は顕著に減少し、これらのParB変異型ミニプラスミドばParIによる分配阻害を受けなくなることが明らかになった。以上の結果からParIはParBのR-fingerにおいてParAと競合することで分配を阻害することが推測された。昨年度までに自己伝達性広宿主域プラスミドRP4の接合伝達過程で一過的に誘導される転写産物をマイクロアレイで検出することに成功した。受容菌では、リプレッサーの制御下にある複数のオペロンの転写が顕著に誘導された。一方供与菌では、oriT近傍に存在するtraJオペロンが顕著に転写誘導されることを見出した。5'-RACE法によりtraJの転写開始点を同定したところ、転写開始点は伝達始点よりも24塩基上流に位置することが明らかになった。traJ mRNAの5'末端24塩基は伝達鎖を鋳型とすることから、traJオペロンが転写されるのは伝達鎖が供与菌内に存在する場合、すなわち伝達開始前もしくは相補鎖合成後に限定されることを示した。

IncP-7组甲苯降解质粒pDK1在假单胞菌中稳定维持，但在KT2440菌株中极不稳定。在 KT2440 菌株中，parI 的基因破坏提高了小质粒的稳定性，而在荧光假单胞菌 Pf-5 菌株中，parI 在 LacI^q 控制下从 tac 启动子表达，导致小质粒在 IPTG 浓度下活化。依赖方式变得不稳定。由上可知，ParI是抑制IncP-7群质粒分布的KT2440株特异性宿主因子。研究还表明，类着丝粒序列 parS 的数量越多，就越容易受到 ParI 的破坏。接下来，研究表明 ParI 的 ATPase 结构域对于 ParI 的分配抑制活性至关重要。此外，通过用Lys或Ala替换被认为是ParB的R指的Arg93，小质粒的稳定性显着降低，并且很明显这些ParB突变型小质粒不再容易受到ParI的分布抑制就成了。从以上结果推断，ParI通过与ParB的R指中的ParA竞争来抑制分配。去年，我们成功地使用微阵列检测在自传广宿主范围质粒RP4的接合转移过程中瞬时诱导的转录本。在受体细菌中，抑制子控制下的多个操纵子的转录被显着诱导。另一方面，在供体细菌中，我们发现位于oriT附近的traJ操纵子的转录被显着诱导。当使用5'-RACE法鉴定traJ的转录起始位点时，发现转录起始位点位于传输起始位点上游24个碱基处。由于traJ mRNA的5'端24个碱基使用转移链作为模板，因此只有当供体细菌中存在转移链时，即在转移开始之前或互补链合成之后，traJ操纵子才会被转录。。