藍藻ホスホリブロキナーゼのX線構造解析による反応機構と活性制御機構の解明

通过蓝绿藻磷酸脂激酶的X射线结构分析阐明反应机制和活性控制机制

基本信息

批准号：
18770087
负责人：
松村浩由
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は,藍藻ボスホリブロキナーゼ(PRK)の反応機構ならびに活性調節機構をX線構造解析によって解明することを目的とし,以下の実験を行った。藍藻Synecococcus由来PRKの大量培養・精製系を構築した。精製手順は、藍藻PRKを大量に生産した大腸菌を破砕し,硫安分画,Niアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーで精製を行った。その後、動的溶液光散乱法装置(DLS)を用いて,溶液状態でのサンプルの結晶化能を確認した。続いて、His-tagドメインを有した酵素を用いて、結晶化を行った。恒温インキュベータ(20℃と4℃)で、種々の結晶化条件の検討を行ったところ、PEG3350を沈殿剤として用いた条件で、0.2x0.2x0.2mm程度のX線回折実験に適した大きさの単結晶を作成することに初めて成功した。しかし、大型放射光施設Spring-8にてX線回折実験を行ったところ回折能3.8Å程度と、構造解析には不十分であった。次に,ThrombinによってHis-tagドメインを切断し、さらに、PRKの本体をゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。その後、結晶化を行ったところ,0.05mm程度の単結晶を作成することに成功したが、大きさが不十分であり、構造解析可能な回折データが得られなかった。次に、PRKの活性調節因子であるCP12タンパク1質の精製系の構築にとりくんだ。PRKとCP12の結合をpull-downassayにて確認したが、結晶が得られなかった。続いて、CP12タンパク質のPRK結合ペプチドを合成し、PRKとCP12の結合をpull-down assayにて確認し、その後結晶化を行ったところ、0.05mm程度の単結晶を作成することができた。現在、結晶の改善を目指し、PRKとCP12ペプチド複合体の結晶化を行っている。

本研究的目的是通过X射线结构分析阐明蓝绿藻bosphoribrokinase（PRK）的反应机制和活性调节机制，并进行了以下实验。我们构建了源自蓝绿藻聚球藻的 PRK 的大规模培养和纯化系统。纯化过程包括破坏产生大量蓝绿藻 PRK 的大肠杆菌，并使用硫酸铵分级分离、Ni 亲和层析和凝胶过滤层析进行纯化。然后，使用动态溶液光散射（DLS）确认溶液状态下样品的结晶能力。随后，使用具有His标签结构域的酶进行结晶。在恒温培养箱（20°C和4°C）中检查各种结晶条件后，我们发现使用PEG3350作为沉淀剂，成功获得了适合X射线衍射实验的尺寸约0.2x0.2x0.2mm。首次制造单晶。然而，当我们在大型同步辐射装置Spring-8进行X射线衍射实验时，衍射功率约为3.8 Å，不足以进行结构分析。接下来，用凝血酶切割His标签结构域，并通过凝胶过滤色谱法进一步纯化PRK的主体。随后的结晶成功地形成了约0.05毫米的单晶，但尺寸不够，无法获得用于结构分析的衍射数据。接下来，他们致力于构建 CP12 蛋白 1（PRK 活性调节剂）的纯化系统。 PRK与CP12之间的结合通过pull-down实验得到证实，但没有获得晶体。接下来，我们合成了CP12蛋白的PRK结合肽，通过pull-down实验确认了PRK与CP12之间的结合，然后进行结晶，并能够产生约0.05mm的单晶。目前，我们正在结晶PRK和CP12肽复合物，目的是改善晶体结构。