金属ナノ粒子－タンパク質複合体の生体内一段階調製プロセスの開発

金属纳米颗粒-蛋白质复合物一步体内制备工艺的开发

• 批准号: 12J05872
• 负责人: 二井手 哲平
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012 至 2013
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J05872/
• 关键词: 金ナノ粒子; アフィニティペプチド; 酵素反応; グリセロールデヒドロゲナーゼ; 酸素反応

本研究では、グリセロールデヒドロゲナーゼ(GLD)によるNADH補酵素再生系に対して、金結合性ペプチドを融合した機能性タンパク質を共存させることで、目的とする機能性タンパク質が金ナノ粒子表面に修飾された金ナノ粒子-タンパク質複合体の調製を試みた。まず、3つの異なる機能(精製用タグとしてヘキサヒスチジンタグ(His-tag)およびグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)、抗体結合ドメインとしてプロテインGおよびプロテインA、金結合ペプチドとしてA3ペプチド)を有する機能性タンパク質をデザインした。また、各ドメインが金ナノ粒子の形成や結合に与える影響を評価するために、A3ペプチドを欠損させたタンパク質および精製用タグを欠損させたタンパク質も調製し、評価に用いた。その結果、抗体結合ドメイン融合タンパク質存在下においてもGLD酵素反応による金ナノ粒子合成反応は進行し、生成した金ナノ粒子表面に当該融合タンパク質が結合していることを確認した。さらに、得られた抗体結合ドメイン修飾金ナノ粒子を用いたEnzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)の結果から、金ナノ粒子上に固定化された融合タンパク質は、金結合性ペプチドを介してその機能を保持した状態で金ナノ粒子上に固定化されていることが明らかとなった。さらに、大腸菌由来GLDに代え、より安定で結晶構造が入手可能なBacillus stearothermophlius由来GLD (BsGLD)を用いてタンパク質修飾金ナノ粒子の調製を試みた。BsGLDの高次構造情報を基に、機能性タンパク質と金結合ペプチドの双方を遺伝子工学的手法により融合させた新規キメラタンパク質を調製することで、単一タンパク質成分によるタンパク質修飾金ナノ粒子の一段階合成を試みた。その結果、金ナノ粒子合成と粒子表面への提示を一種類の融合タンパク質が担う金ナノ粒子-タンパク質複合体の調製に成功した。また、本手法により調製された金ナノ粒子上に固定されたタンパク質の機能が十分に保持されていることをELISAにより確認した。

在这项研究中，我们试图制备一种金纳米颗粒 - 蛋白质复合物，其中通过在甘油脱氢酶（GLD）中与NADH联氮酶再生系统中的NADH联合酶再生系统中与金固定肽融合的功能蛋白在金纳米颗粒表面进行了修饰。首先，设计了具有三种不同功能的功能蛋白（六位抗性标签（HIS-TAG）和谷胱甘肽S-转移酶（GST）作为纯化标签，蛋白G和蛋白A作为抗体结合结构域，而A3肽作为金肽作为金结合肽）。此外，为评估每个结构域对金纳米颗粒形成和结合的影响，制备了具有A3肽缺乏的蛋白质和带有纯化标签的蛋白质的蛋白质并用于评估。结果，即使在存在抗体结合结构域融合蛋白的情况下，GLD酶反应对金纳米颗粒的合成反应也会发展，并且已经证实融合蛋白与生产的金纳米颗粒的表面结合。此外，使用所得的抗体结合结构域修饰的金纳米颗粒的酶联免疫吸附测定法（ELISA）的结果表明，固定在金纳米颗粒上的融合蛋白在金纳米颗粒上固定在金纳米颗粒上，同时通过金纳米粒子固定在金纳米粒子上，同时通过金构成金固定的效果。此外，我们试图使用来自芽孢杆菌（BSGLD）的gld制备蛋白质改性的金纳米颗粒，而不是大肠杆菌衍生的GLD，它更稳定并且具有晶体结构。基于BSGLD的结构信息，我们试图通过制备一种新型的嵌合蛋白来使用单个蛋白质成分合成蛋白质改性的金纳米颗粒，其中功能性蛋白质和金结合肽均由基因工程方法融合。结果，我们已经成功制备了金纳米粒子 - 蛋白质复合物，其中一种融合蛋白负责合成金纳米颗粒并在颗粒表面上表现出来。此外，ELISA证实，通过该方法制备的金纳米颗粒上固定在金纳米颗粒上的蛋白质的功能得到了充分的维护。

项目成果

One-pot fabrication of protein-gold nanoparticle conjugate by enzymatic reaction

酶促反应一锅法制备蛋白质-金纳米粒子缀合物

• 发表时间: 2012
• 作者: T. Niide;R. Wakabayashi;M. Goto;N. Kamiya;二井手哲平;二井手哲平;二井手哲平;二井手哲平;二井手哲平
• 通讯作者: 二井手哲平

酵素反応を利用したタンパク質修飾金ナノ粒子の一段階合成

酶促反应一步合成蛋白质修饰金纳米颗粒

• 发表时间: 2013
• 作者: 二井手哲平;若林里衣;後藤雅宏;神谷典穂
• 通讯作者: 神谷典穂

Enzymatic approach for synthesis of protein-gold nanopartfcle conjugates

蛋白质-金纳米粒子缀合物的酶法合成

• 发表时间: 2012
• 作者: T. Niide;R. Wakabayashi;M. Goto;N. Kamiya;二井手哲平;二井手哲平;二井手哲平;二井手哲平
• 通讯作者: 二井手哲平

Enzymatic self-sacrificial display of an active protein on gold nanoparticles

金纳米粒子上活性蛋白质的酶促自我牺牲展示

• DOI: 10.1039/c3ra46384b
• 发表时间: 2014
• 期刊: RSC Adv.
• 作者: T. Niide;M. Goto;N. Kamiya
• 通讯作者: N. Kamiya

Enzymatic fabrication of protein-gold nanoparticle conjugates by a one-pot, one-protein-component system

通过一锅、一种蛋白质组分系统酶法制备蛋白质-金纳米颗粒缀合物

• 发表时间: 2014
• 作者: T. Niide;M. Goto;N. Kamiya
• 通讯作者: N. Kamiya